1.     Основное направление исследований

Исследование регуляторных районов генов и потенциально регуляторных SNPs; их выявление в масштабе генома. Изучение механизмов канцерогенеза: поиск регуляторных SNPs, связанных с развитием рака легких и толстого кишечника, выяснение роли тканеспецифичных транскрипционных факторов в механизмах гепатоканцерогенеза, изучение новых противоопухолевых препаратов. Выяснение молекулярных механизмов развития депрессии.

Задачи, решаемые в рамках основного направления на данном этапе:

1. Полногеномный поиск регуляторных SNPs, связанных с развитием рака легких и толстого кишечника, экспериментальное исследование вновь открытых SNPs. Детальное изучение регуляторного потенциала SNPs во втором интроне гена K-ras (рак легких)  и альтернативных промоторах  гена АРС (колоректальный рак) с помощью идентификации транскрипционных факторов, связывающихся с данными районами, и определения влияния SNPs на экспрессию репортерных генов.
2. Изучение изменений транскриптома фронтальной коры головного мозга и гипоталамуса при развитии депрессивно-подобных состояний на модели социального стресса  мышей. Выявление новых генов и регуляторных SNPs, сопряженных с этой патологией.
3. Исследование новых противоопухолевых препаратов. Разработка способов адресной доставки препаратов для диагностики и терапии злокачественных опухолей. 

2.     Аннотация базового бюджетного проекта подразделения

Бюджетный проект VI.58.1.2. «Молекулярно-генетические основы транскрипционной регуляции» (координатор проекта: д.б.н. проф. Т.И. Меркулова). В рамках проекта запланировано проведение комплексных экспериментально-теоретических  исследований, направленных на изучение регуляторного кода ДНК  эукариот  и выяснение  механизмов определяющих характер транскриптома эукариотической клетки. Лаборатория регуляции экспрессии генов отвечает за блок 3 бюджетного проекта: «Поиск и функциональный анализ потенциально регуляторных SNPs в геноме человека» 

4.     Иллюстрированное описание лучших результатов, полученных подразделением за последние 5 лет

Получены принципиально важные результаты, указывающие на ключевую роль специфичного для печени транскрипционного фактора и известного ксеносенсора CAR (конститутивный рецептор андростанов)  в механизмах химически индуцированного гепатоканцерогенеза.

На модели инбредных мышей, чувствительных (C3H) и устойчивых (C57BL и CC57BR) к действию фенобарбитала как промотора опухолей печени, показана определяющая роль CAR в механизме действия этого соединения. Установлено, что только в печени мышей  С3Н фенобарбитал активирует СAR (рис.1А,Б) и усиливает экспрессию его генов–мишеней: Sult2a1- основного фермента катаболизма тиреоидных гормонов (рис.1В), и Mdm2 - важного регулятора пролиферации и апоптоза (рис.1Г). Таким образом,  CAR-опосредованная стимуляция гепатоканцерогенеза фенобарбиталом может осуществляться за счет одновременного подавления опухолесупрессорной функции тиреодных гормонов и индукции генов, непосредственно контролирующих пролиферацию и апоптоз [Life Sci., 2010].

Рисунок 1. Фенобарбитал (ФБ) увеличивает ДНК-связывающую активность CAR и уровень мРНК Sult2A1 и mdm2 в печени мышей С3Н, но не CC57BR и C57BL. А) Типичный радиоавтограф изменения ДНК-связывающей активности CAR. Б) Результаты количественной обработки радиоавтографов. За единицу принята активность CAR в печени животных, не получавших ФБ. В скобках – количество экспериментов. В), Г). Данные RT-QPCR по уровню экспрессии генов Sult2A1(В) и mdm2(Г) представлены в относительных единицах от уровня экспрессии Gapdh. Достоверные отличия от животных, не получавших ФБ * – Р<0,05; ** – Р<0,01; *** – Р<0,005.

С использованием мышей, нокаутных по СAR, показано, что гепатоканцерогенные аминоазокрасители ОАТ и 3’-МеДАБ является лигандами этого белка, повышающими его активность, что приводит к усилению экспрессии генов-мишеней СAR,. Среди генов-мишеней выявлен известный протоонкоген c-Myc, активация которого усиливает пролиферацию и приводит к злокачественному перерождению клеток. Показано, что пролиферация клеток печени под действием гепатоканцерогена ОАТ действительно хронически повышена у контрольных животных и не изменена у CAR- дефицитных мышей [Toxicology and Applied Pharmacology, 2012].

Разработан новый подход к предсказанию регуляторных районов в геноме человека и выявлению потенциально регуляторных SNPs (rSNPs), основанный на использовании данных международного проекта ENCODE по распределению мест связывания факторов транскрипции, полученных в результате ChIP-seq анализа. Подход базируется на предположении о том, что обогащение района генома участками связывания факторов транскрипции (пики ChIP-seq) указывает на его регуляторную функцию, и соответственно SNPs, попадающие в этот район, являются потенциально регуляторными (Рис.2А). 

Анализ баз данных SNPs, связанных с фенотипическими проявлениям, показал, что такие выборки существенно обогащены предсказанными нами rSNPs по сравнению с массивами случайно отобранных SNPs (Рис. 2Б). 40 SNPs, попавших в район перекрывания по крайней мере семи пиков ChIP-seq, были экспериментально протестированы методом задержки в геле с использованием экстрактов ядер 4-х клеточных линий человека (HepG2, HeLaS3, HCT-116, and K562). Для 29 SNPs  было показано радикальное изменение в картине связывания ядерных белков хотя бы одной клеточной линии (примеры на рис. 3В), еще для 6 SNPs найдены менее выраженные изменения. Вместе взятые эти данные свидетельствуют об эффективности предложенного нами подхода [PLOS ONE, 2013].

Впервые осуществлена реалистичная оценка возможностей и ограничений компьютерных методов, применяемых для интерпретации данных по полногеномному распределению сайтов связывания транскрипционных факторов (ChIP-Seq). Использованы построенные нами  методы распознавания FoxA, основанные на двух наиболее часто используемых принципах: обнаружении нуклеотидных мотивов в последовательностях de novo (mono- и diChipmunk) и обучении по выборке известных сайтов связывания (PWM и SiteGA). Для выбора корректных порогов для всех четырех методов распознавания результаты работы каждого из них  были экспериментально верифицированы с помощью метода EMSA (Рис 3 А). Пример эксперимента по верификации показан на Рис.3 Б. Затем методы  были применены для распознавания  сайтов связывания FoxA2 в пиках ChIP-Seq двух независимых экспериментов. В результате впервые удалось надежно определить точную локализацию и число сайтов связывания FoxA  в пиках ChIP-Seq. Наборы FoxA2 сайтов, выявленных разными методами, существенно отличаются, что подтверждает развиваемую нами концепцию структурной гетерегенности сайтов связывания транскрипционного фактора [J Steroid Biochem Mol Biol, 2009]. Одновременное использование методов, относящихся к разным классам (например, SiteGA и DiChipmunk) позволяет идентифицировать существенно больше сайтов связывания FoxA2 и соответственно ChIP-seq пиков, содержащих эти сайты (Рис 3 В). [BMC Genomics, 2014]

Рисунок 3. А. Примеры подбора порогов для различных методов распознавания. Вертикальная прерывистая линия соответствует порогу метода, выше которого экспериментально подтверждаются все предсказанные сайты  Б. Конкуренция олигонуклеотидов в EMSA за рекомбинантный белок GST-FoxA2. Проба - радиоактивно меченый олигонуклеотид TTR с известным сайтом связывания FoxA2. В качестве конкурента к пробам добавлялся возрастающий избыток исследуемых немеченых олигонуклеотидов. Полоса, соответствующая ДНК-белковому комплексу, отмечена стрелкой. В. Зависимость числа пиков ChIP-seq, содержащих хотя бы один предсказанный сайт, от высоты пика.

5.     Задачи, планируемые на перспективу

• Выявление новых  регуляторных SNPs, которые могут быть связанны с развитием различных патологий, за счет интеграции данных проекта ENCODE по участкам связывания транскрипционных факторов, гистоновым меткам активного и неактивного хроматина и аллель-специфичной экспрессии генов, а также данных GWAS. Экспериментальное изучение отдельных   SNPs.
• Изучение изменений в картине межгенных контактов в клетках  фронтальной коры головного мозга и гипоталамуса при развитии депрессивно-подобных состояний с использованием модели социального стресса  мышей. Определение наборов генов, промоторы которых сближены в пространстве за счет использования общего пула молекул РНК полII, транскрипционных факторов и коактиваторов.
• Изучение биораспределения и эффективности  терапевтических химиопрепаратов и терапевтических нуклеиновых кислот (малых интерферирующих РНК, микроРНК и др.) в составе новых модульных систем для мишень-направленной доставки.

Бывшие сотрудники

Совместители