1.     Основное направление исследований 

Изучение структурно-функциональной организации белков

2.     Задачи, решаемые в рамках базового бюджетного проекта на данном этапе:

В рамках проекта VI.61.1.2. «Компьютерно-экспериментальное исследование и моделирование структурно-функциональной организации и эволюции генных сетей многоклеточных и одноклеточных организмов» решаются задачи по направлению компьютерный анализ и моделирование структурно-функциональной организации белков, включая:

(1) совершенствование существующих и разработка новых алгоритмов компьютерной структурно-функциональной аннотации белков (методы молекулярного моделирования, методы предсказания сайтов связывания малых химических соединений, сайтов белок-белок взаимодействий, активных центров и методы предсказания термодинамической стабильности белков);

(2) исследование взаимосвязи между структурой белков и их функциональными, аллергенными и иммуногенными свойствами на основе анализа конформационных пептидов, моделирующих белковые молекулярные поверхности;

(3) изучение закономерностей структурной организации функциональных сайтов белков;

(4) анализ закономерностей структурной организации ассоциативных сетей белок-белок взаимодействий, связанных с заданной клеточной/системной функцией, биологическим процессом или заболеванием;

(5) разработка новых подходов для поиска фармакологических мишеней и дизайна молекулярных соединений – кандидатов для лекарственных препаратов и проведение, на этой основе, компьютерного дизайна/скрининга ряда химических соединений, обладающих потенциальным противовирусным и антибактериальным действием;

(6) изучение влияния мутаций на изменение термостабильности белков, функционирующих в составе изучаемых генных сетей, с использованием методов молекулярной динамики.

(7) создание интегрированных информационных хранилищ данных по структуре, функции и эволюции белков. С помощью интегрированных подходов будет проводиться анализ метапротеомов бактериальных сообществ.

3.     Прикладные разработки

Разработана программно-информационная система Protein Structure Discovery (Иванисенко и др., 2011), предназначенная для решения широкого круга задач компьютерной протеомики, включая предсказание функции, структуры и иммунологических свойств белков. Специально созданный раздел системы позволяет оценивать количественные и качественные эффекты мутаций на структурные и функциональные свойства белков.

Всего в систему интегрировано более 20 различных программ, в том числе база данных PDBSite (Ivanisenko et al, 2005), содержащая информацию о пространственных структурах более 100000 функциональных сайтов белков, программа распознования функциональных сайтов в пространственных структурах белков PDBSiteScan (Ivanisenko et al, 2004), программа количественного анализа взаимосвязи структура-активность белков WebProAnalyst (Ivanisenko et al, 2005), система SitEx (Medvedeva et, al, 2012), предназначенная для решения задач по анализу соотношения экзон-интронной структуры генов и структурно-функциональной организации, кодируемых ими белков; программа Allpred (Bragin et al, 2013), предназначенная для предсказания аллергенности белков с использованием конформационных пептидов и другие.

Protein Structure Discovery имеет Вэб-интерфейс и доступна пользователям через Интернет (http://www-bionet.sscc.ru/psd).

4.     Иллюстрированное описание лучших результатов, полученных подразделением за последние 5 лет. Общий объем текста на одну лабораторию (сектор) – не более 4000 знаков с пробелами, количество иллюстраций с подписями: от одной до – пяти. Рекомендуется, чтобы общий объем текста с иллюстрациями не занимал более 5 страниц в формате Word (для текста шрифт Nimes New Roman, фонт № 12, через 1 интервал).

1) Разработана компьютерная система ANDSystem автоматического анализа текстов научных публикаций и баз данных (Demenkov et al, 2011). Система содержит модуль извлечения знаний из текстов и баз данных, базу знаний ANDCell и программу ANDVisio, обеспечивающую доступ к базе знаний и визуализацию ассоциативных генных сетей (рис. 1). Система позволяет автоматически извлекать из текстов информацию о широком круге взаимодействий и взаимоотношений между белками, генами, микроРНК, метаболитами, болезнями и биологическими процессами, включая физические взаимодействия, регуляторные отношения, транспорт и др.

Рисунок 1. Схематичное представление системы ANDSystem автоматического извлечения знаний из текстов научных публикаций и биологических баз данных.

2) Найден гипотетический рецепторный домен служащий рецептором для проникновения прионов и вирусов в клетку (Малыгин и др. 2009). Проведено компьютерное моделирование пространственной структуры ламининсвязывающего белка человека (LBP). Показано, что разрывные участки последовательности C-концевого домена LBP, взаимодействующие с гликопротеином Е вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE) и вируса клещевого энцефалита (TBE), оказываются сближенными в пространственной структуре и образуют рецепторный домен. Кроме того, анализ показал, что данный домен служит рецептором для проникновения прионов в клетку, таким образом, существует общий путь проникновения для вирусов и прионов (рис. 2).

3) Компьютерный анализ белка PII Mycobacterium tuberculosis, являющегося важнейшим регулятором метаболизма азота, сигнальной трансдукции и мембранного транспорта в микобактерии, проведенный с использованием программы PDBSiteScan и молекулярной динамики, выявил в данном белке сайты связывания 2-кетоглютората (рис. 3). Молекулярное моделирование показало, что связывание 2-кетоглютората приводит к перестройке белка PII и повышению его сродства к АТФ. Экспериментальная проверка на приборе BIOCORE подтвердила результаты компьютерного анализа (Bandyopadhyay et al., The Journal of Biochemistry, 2010). Таким образом, показано, что 2-кетоглюторат действует как аллостерический регулятор связывания PII с ATФ.

Рисунок 3. Графическое изображение фрагмента модели пространственной структуры белка PII в комплексе с АТФ и 2-кетоглютарат.

4) На основе анализа экспериментальных данных протеомных исследований, полученных в Институте физико-химической медицины (Москва) проведена реконструкция и анализ сетей молекулярно-генетических взаимодействий белков Helicobacter pylori, дифференциально экспрессирующихся в различных штаммах, выделенных у пациентов с хроническими гастритами и опухолями желудка (рис. 4). Показано, что различия в экспрессии белков H. pylori могут быть связаны с адаптацией этого микроорганизма к различным условиям внешней среды, обусловленными морфологическими отличиями различных участков желудка, подверженных гистологическим и морфологическим изменениям в ходе патологических процессов (Momynaliev et al, 2010). Для реконструкции ассоциативных сетей использовалась система автоматического анализа текстов научных публикаций и баз данных ANDSystem.

Рисунок 4. Ассоциативные сети взаимосвязанных белков H. pylori, идентифицированных в протеомных экспериментах, построенные с использованием системы автоматического анализа научных текстов ANDSystem.

5) С использованием компьютерной системы ANDSystem проведена реконструкция и анализ ассоциативной сети, описывающей потенциальные молекулярные механизмы взаимосвязи миопии и открытоугольной глаукомы (Подколодная и др., 2010). Показано, что ассоциативная сеть содержит более 200 различных генов, ассоциированных с этими заболеваниями, и более чем 2000 молекулярно-генетических взаимодействий между данными генами. Редукция сети и дальнейший анализ представленных в ней молекулярно-генетических путей позволили выявить ряд потенциальных генов-кандидатов для генотипирования одновременно миопии и открытоугольной глаукомы (рис. 5).

А

Б

В

Рисунок 5. Молекулярно-генетические пути, ассоциированные с открытоугольной глаукомой и миопией. (А) Наиболее значимые взаимодействия между генами и белками человека, ассоциированными с открытоугольной глаукомой и миопией; (Б) пути, направленные от миопии к глаукоме; (В) пути, с нечетко определенным типом и направлением взаимодействий.

6) Разработан (совместно с Институтом физико-химической биологии ФМБА) новый подход к поиску белков, перспективных для биотехнологии (Иванисенко и др., 2012). Подход основан на параллельном высокопроизводительном секвенировании метагеномов и компьютерном анализе: сборке коротких секвенированных фрагментов в протяженные геномные последовательности (контиги); поиске в них открытых рамок считывания; функциональной классификации кодируемых ими ферментов и предсказании количественных величин их функциональной активности. На основе анализа результатов секвенирования метагенома микробных сообществ озера «Кротовья ляга», выполненного на платформе SOLiD, идентифицирован белок гликозидаза (фермент деградации целлюлозы) с высокой функциональной активностью (рис. 6).

Рисунок 6. Новый подход к поиску белков, перспективных для биотехнологии, основанный на параллельном высокопроизводительном секвенировании метагеномов и компьютерном анализе. (а) Озеро «Кротовья ляга» - источник генетического материала для метагеномного секвенирования микробных сообществ; (б) распределение длин нуклеотидных последовательностей, собранных в контиги; (в) фрагмент множественного выравнивания белковых последовательностей, потенциальных гликозидаз, кодируемых открытыми рамками считывания; (г) предсказание значения количественной величины константы Михаэлиса для потенциальной гликозидазы в реакции расщепления целлобиозы; (д) реконструированная модель пространственной структуры гликозидазы, обладающей повышенной активностью расщепления целлобиозы.

7) Предсказана мишень действия соединения NIH415032 (рис. 7), обладающего согласно экспериментальным данным противотуберкулезной активностью (Gahoi et al, 2013). С использованием программы PDBSiteScan и методов виртуального скрининга показано, что миколилтрансфераза (антиген 85) M. tuberculosis, один из ключевых ферментов, участвующих в биосинтезе микобатериальных клеточных стенок, является потенциальной мишенью для соединения NIH415032, для которого ранее было показана противотуберкулезная активность, но мишень его действия была не известна (Gahoi et al, 2013).

8) С помощью программы предсказания функциональных сайтов в пространственных структур белков PDBSiteScan и методов молекулярной динамики изучен структурный эффект действия мутации Gly245-Сys в ДНК-связывающем домене белка p53, ассоциированной с наследственной предрасположенностью к раку (синдром Ли-Фраумени). Показано, что мутация приводит к появлению нового сайта связывания иона цинка в непосредственной близости с существующим цинк-связывающим сайтом (рис. 8). Смещение иона цинка в данный сайт ведет к существенным конформационным перестройкам белка, что может обуславливать нарушения его функций (Pintus et al, 2013).

Рисунок 8. Графическое изображение фрагмента пространственной структуры ДНК-связывающего домена белка p53, в котором согласно расчетам в результате мутации Gly245-Сys возникает новый цинк-связывающий сайт.

5.     Задачи, планируемые на перспективу: формулировки должны содержать как фундаментальные научные задачи, так и возможную прикладную направленность исследований в подразделении.

Белки представляют собой важнейшую компоненту ГС. Наряду со структурными, каталитическими, транспортными функциями, белки в ГС выполняют важнейшие регуляторные функции: контролируют экспрессию генов, обеспечивают формирование сетей белок-белковых, РНК/ДНК-белковых и белок-лигандных регуляторных взаимодействий, путей передачи сигналов от клеточных мембран к ядрам клеток, межклеточных коммуникаций. Функциональная активность белков в ГС определяется наборами характерных для них функциональных сайтов. По данным базы PDB (Rose et al., 2011) в расшифрованных пространственных структурах белков может содержаться от нескольких до десяти и более функциональных сайтов.

Однако, база данных PDB содержит в настоящее время описание 3-D структур только для ~ 80 000 белков. Из них уникальные пространственные структуры составляют ~ 15%, а остальные являются изоформами или мутантными формами. При этом в PDB представлено около 20 000 уникальных 3-D структур белков человека, имеющих гомологию менее 95%. Таким образом, до сих пор имеется большой разрыв между информацией, представленной в базе данных и полным количеством белков, кодируемых геномом человека с учетом вариантов альтернативного сплайсинга, что затрудняет оценку влияния генетической изменчивости на функциональные сайты белков.

Поэтому важнейшее значение имеет создание высокопроизводительных конвейерных методов компьютерного предсказания функциональных сайтов в пространственных структурах белков. В связи с этим планируется решение следующих задач из области компьютерного анализа структурно-функциональной организации белков, функционирующих в биомедицински значимых ГС человека: предсказание компьютерными методами функциональных сайтов в пространственных структурах этих белков; оценка на этой основе репертуаров белок-белковых, РНК/ДНК-белковых и метаболит-белковых взаимодействий, и реконструкция сетей межмолекулярных взаимодействий, значимых для функционирования изучаемых ГС; картирование аминокислотных полиморфизмов на функциональные сайты белков и изучение на этой основе влияния мутаций на структуру и функцию белков, а также на формируемые ими сети межмолекулярных взаимодействий; изучение влияния мутаций на термодинамическую стабильность и специфическую активность белков, а также на структурные и конформационные свойства функциональных сайтов в трехмерной структуре белков.

Короткие природные пептиды обладают широкой биологической активностью, включая регуляцию деятельности высшей нервной системы. Механизмы их действия до сих пор остаются слабо изученными. Наша идея состоит в том, что пептиды могут взаимодействовать с рецепторами за счет структурной мимикрии функциональных сайтов белков, для которых эти рецепторы являются мишенями. Будет создана база данных выравниваний последовательностей коротких пептидов с конформационными пептидами белков, характеризующая потенциальные молекулярные функции коротких пептидов и их мишени по аналогии с белками, имеющими сходство с этими пептидами.

Будет создан параллельный алгоритм для предсказания функциональных сайтов в 3-D структурах белков на основе метода PDBSiteScan. Будут предсказаны функциональные сайты в пространственных структурах белков, функционирующих в составе изучаемых ГС, включая сайты, возникающие в результате генетической изменчивости, с помощью новой версии программы. Особое внимание будет обращено на функциональные сайты белков, выполняющих регуляторные функции (сайты аллостерической регуляции белков; сайты связывания РНК/ДНК, сайты, участвующее в формировании сетей белок-белковых взаимодействий).

Будет создана реляционная версия базы данных PDBSite, интегрирующая информацию по экспериментально установленным и предсказанным (потенциальным) сайтам в 3-D структуре белков. Будет проведена классификация сайтов по сходству их пространственных структур, физико-химических и конформационных свойств, создание обобщенных шаблонов, описывающих различные структурные и функциональные классы сайтов. Будет осуществлена интеграция PDBSite с внешними базами данных Gene Ontology (GO), UniProt, PDB и др.

Будет осуществлено расширение базы данных PDBSite: картирование микроэволюционной (популяционной) и макроэволюционной генетической изменчивости на пространственные структуры и функциональные сайты белков, функционирующих в составе изучаемых ГС, включая:

- популяционные полиморфизмы из баз данных "1000 геномов", dbSNP, OMIM и др.

- нуклеотидные и аминокислотные замены, выявляемые во множественных выравниваниях семейств белков, функционирующих в составе изучаемых ГС;

- особое внимание будет обращено на аминокислотные замены в белках, выполняющих в исследуемых ГС регуляторные функции, а также ассоциированных с социально значимыми заболеваниями человека.

Будет осуществлено развитие методов молекулярного моделирования динамики и механики белков для анализа функциональных сайтов и их взаимодействия с различными лигандами, включая малые химические соединения, белки, молекулы РНК и регуляторные сайты в ДНК.

Будет разработан параллельный алгоритм для оценки изменений термодинамической стабильности мутантных белков на основе методов ProtStability.

Будет исследовано влияние аминокислотных замен, представленных в базе данных PDBSite, на термодинамическую стабильность и специфическую активность белков, в том числе белков, функционирующих в составе изучаемых ГС.

Будет исследовано влияние аминокислотных замен, представленных в базе данных PDBSite, на структурные и конформационные свойства функциональных сайтов белков, включая сайты, локализованные в белках, функционирующих в составе изучаемых ГС. Будет изучено влияние замен аминокислот на конформационную подвижность сайтов, изменения их физико-химических характеристик, устойчивость сетей водородных связей, формируемых аминокислотными остатками функциональных сайтов и т.д.

Будет создан параллельный алгоритм для предсказания величин специфических активностей белков на основе разработанного нами ранее метода WebProAnalyst, использующего в качестве исходной информации множественные выравнивания семейств белков с известными величинами их специфической активности. Будет проведен анализ влияния аминокислотных замен, описанных в базе PDBSite, на специфическую активность белков, включая белки, функционирующие в составе изучаемых ГС.

Будет проведена интеграция разработанных информационных и программных продуктов в систему «КОМПЬЮТЕРНАЯ ПРОТЕОМИКА» для конвейерного высокопроизводительного анализа структурно-функциональной организации белков и их функциональных сайтов, обеспечивающего:

- предсказание пространственной (3-D) структуры белков по их аминокислотным последовательностям;

- быстрый поиск структурной гомологии белков по базе данных PDB;

- предсказание функциональных сайтов в 3-D структурах белков;

- количественный анализ взаимосвязи «структура-активность» в семействах родственных и мутантных белков;

- предсказание изменения термодинамической стабильности мутантных белков;

- молекулярное моделирование динамики и механики белков;

- оценку влияния аминокислотных замен в белках на их структурно-функциональные характеристики.

Будет создана база знаний по вывяленным особенностям структурно-функциональной организации белков, функционирующих в составе изучаемых ГС, включая влияние мутаций на их структуру и функцию, и расширение на этой основе ГС.

Совместители