1.      Основное направление исследований

 Исследование механизмов, контролирующих устойчивость растений к стрессам. Разработка методов создания растений с заданными технологическими свойствами с помощью подходов системной биологии и генной инженерии. Изучение структурно-функциональной организации генов растений и механизмов контроля экспрессии на посттранскрипционном уровне. Разработка компьютерных методов для предсказания кодирующего потенциала генов эукариот и оптимизации экспрессии трансгенов в растениях.

 Задачи, решаемые в рамках основного направления на данном этапе:

1. Изучение молекулярных механизмов устойчивости растений к фитопатогенам (на модели трансгенных растений). Разработка способов получения растений с увеличенной устойчивостью к фитопатогенам с помощью методов генной инженерии. Объекты исследований: Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Phytophthora infestans, Phytophthora parasitica, вирус табачной мозаики, вирусы картофеля А, Y, вироид картофеля.
2. Изучение молекулярных механизмов, контролирующих устойчивость растений к абиотическим стрессам на модели трансгенных растений. Разработка способов получения растений с увеличенной засухо- и холодоустойчивостью с помощью методов генной инженерии. Объекты исследований: Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Zea mays.
3. Контроль экспрессии генов эукариот в условиях стресса на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях. Разработка методов оптимизации экспрессии генетических конструкций в растениях с помощью методов биоинформатики и компьютерного анализа. Исследование полного кодирующего потенциала генов эукариот с помощью методов компьютерной геномики и протеомики.

2.      Аннотация базового бюджетного проекта подразделения

Бюджетный проект VI.53.1.3. «Генетический контроль механизмов несовместимости между растениями разных таксонов и их адаптации к неблагоприятным условиям среды» (координатор проекта: д.б.н. проф. Л. А. Першина). В рамках проекта запланировано проведение комплексных экспериментальных исследований, направленных на изучение генетического контроля механизмов несовместимости между растениями, принадлежащими разным таксонам, и генетического контроля признаков, определяющих адаптивность растений к условиям среды.

Лаборатория генной инженерии отвечает за блок 5 бюджетного проекта: «Исследование генных сетей, контролирующих адаптацию к биотическим и абиотическим стрессам на разных стадиях развития растений, с помощью методов генной инженерии и трансгенеза»

3.      Прикладные разработки.

В лаборатории разработаны способы получения сортов растений с увеличенной устойчивостью к вирусам и абиотическим стрессам (на которые получены патенты и авторские свидетельства), основанных на подходах генной инженерии. Поскольку применение ГМО в практике сельского хозяйства РФ имеет ряд существенных ограничений, использование этих методов в практике пока не проводится.

4.      Иллюстрированное описание лучших результатов, полученных подразделением за последние 5 лет. Общий объем текста на одну лабораторию (сектор) – не более 4000 знаков с пробелами, количество иллюстраций: от одной до трех – пяти рисунков с подписями. Рекомендуется, что общий объем текста с иллюстрациями должен занимать не более 5 страниц в формате Word (для текста шрифт Times New Roman, фонт № 12, через 1 интервал).

4.1. Найдено, что триплеты в составе молекулы РНК имеют различные физико-химические характеристики, что может быть связано с их функциональной активностью и с возникновением служебных кодонов в составе генетического кода на ранних этапах эволюции жизни.

Обнаружено, что одна из характеристика молекулы РНК «размер поверхности молекулы РНК, доступной для взаимодействия с другими молекулами» (Accessible Surface Area, ASA), зависит от контекста (комбинации нуклеотидов) (рис. 1). Показано, что триплет AUG характеризуется высоким значением этого параметра, что могло служить одной из причин выбора этого триплета в качестве стартового кодона трансляции на ранних этапах эволюции. Кроме этого, высоким значением ASA характеризуется стоп-кодон UGA, а также триплеты в составе сайта Шайна-Дальгарно. Выдвинута гипотеза о том, что величина ASA, отражающая реакционноспособность участка РНК, могла служить одним из факторов, повлиявших на выбор триплетов AUG и UGA в качестве служебных кодонов (работа выполнена совместно с группой Dr. S. Ahmad, National Institute of Biomedical Innovation, Osaka, Japan).

Рисунок 1. Среднее значение ASA для триплетов в составе молекул РНК (также приведено стандартное отклонение) (Singh et al., 2010).

4.2. Обнаружено, что в эукариотических мРНК могут содержаться эволюционно-консервативные альтернативные сайты инициации трансляции и такие мРНК могут дополнительно кодировать новые изоформы белка, различающиеся по размеру N-концевого домена.

Долгое время считалось, что мРНК генов эукариот содержат одну рамку считывания и один стартовый кодон трансляции и возможность кодирования нескольких белков одной мРНК не принималась во внимание. Однако, в последнее время эта ситуация пересматривается, поскольку были получены доказательства частого присутствия альтернативных стартовых кодонов. В частности, нами был проведен компьютерный анализ структурно-функциональной организации эукариотических мРНК, который показал положительную взаимосвязь между эффективностью сигнала инициации трансляции (оптимальностью или субоптимальностью нуклеотидного контекста) и присутствием эволюционно-консервативных альтернативных стартовых кодонов в начале CDS (Bazykin and Kochetov, 2011). Эти данные доказывают функциональную значимость альтернативных сайтов инициации трансляции. (эта работа выполнена совместно с группой Егора Базыкина, Институт проблем передачи информации РАН г. Москва).

Рисунок 2. В таблице показана число эволюционно-консервативных AUG кодонов, присутствующих в начале открытых рамок считывания в мРНК генов позвоночных животных, насекомых и дрожжей (со второго по пятый, десятый, двадцатый и сотый кодоны). На рисунке показана доля эволюционной консервативных альтернативных стартовых кодонов в начале открытых рамок считывания в мРНК человека (со второго по 45 кодон). Можно видеть, что субоптимальный контекст стартового кодона (YnnAUG) сопровождается значительно более высоким уровнем эволюционной консервативности нижерасположенных кодонов AUG, что подтверждает гипотезу об их функциональной значимости.

4.3. Показано, что биологическая роль гена орнитинаминотрансферазы (ОАТ) связана с поддержанием пула свободных аминокислот в норме и при стрессе (особенно в меристемах и быстрорастущих тканях стебля и корня).

ОАТ конвертирует орнитин в пирролин-5-карбоксилат, который может далее переходить в пролин или глутамат. Роль ОАТ не была понятна, так как синтез пролина из орнитина мог представлять собой один из механизмов контроля осмотического давления в клетках растений в ответ на абиотические стрессы. Анализ активности промотора гена ОАТ арабидопсиса показал, что ОАТ экспрессируется на ранних этапах развития проростка и активируется ауксином; при появлении в среде источников неорганического азота происходит индукция экспрессии ОАТ в листьях и в кончиках новообразующихся боковых корней. Это говорит об участии этого фермента в конверсии запасных форм азота (аргинина, орнитина) в глутамат (рис. 3).

Рисунок 3. Схема, демонстрирующая активность промотора гена орнитинаминотрансферазы на ранних стадиях развития проростка (А), при индукции ауксином (Б) и при добавлении в среду источников азота (В).

4.4. Показано, что экстраклеточные РНКазы растительного происхождения могут участвовать в ответе на вирусные инфекции.

Создана новая генетическая модель – линии трансгенных растений Nicotiana tabacum, характеризующиеся либо сниженным уровнем собственной экстраклеточной S-подобной РНКазы Nk1, либо увеличенным уровнем S-подобной РНКазы (ген выделен из Zinnia elegans). Обнаружено, что супрессия гена Nk1 не приводит к изменениям в морфологии и сроках развития трансгенных растений, а увеличенная продукция рибонуклеазы приводит к повышению устойчивости растений к РНК-вирусам разных групп (вирусу табачной мозаики и ожога гречихи).

Рисунок 4. На форезе приведен спектр белков с рибонуклеазной активностью в экстрактах из листьев линий трансгенных растений с супрессированной активностью S-подобной РНКазы (Nk1), нетрансгенных растений и линии с увеличенной активностью S-подобной РНКазы Zinnia elegans (ZnRNase II). Приведены фотографии растений (не зафиксировано изменение морфологических характеристик), а также данные по накоплению антигена вируса табачной мозаики на 7, 14 и 21 дни после инокуляции в контроле (SR1) и линиях растений с высоким уровнем нуклеазной активности (RNS1,5,10).

5.      Задачи, планируемые на перспективу: формулировки должны содержать как фундаментальные научные задачи, так и возможную прикладную направленность исследований в подразделении.

• Реконструкция генных сетей стрессового ответа у растений на основе данных высокопроизводительных протеомных и транскриптомных экспериментов.
• Молекулярно-биологические механизмы, контролирующие паттерны экспрессии генов высших растений (и других эукариот) в условиях стресса.
• Поиск новых регуляторных белков и пептидов, контролирующих развитие и физиологические процессы у растений и других эукариот.
• Разработка способов увеличения устойчивости растений к бактериальному раку (прикладное направление).

Совместители