1.     Основные направления исследований

Протеомика, микробиология, биотехнология.

2.     Бюджетный проект

VI.58.1.3.

Метаболомно-протеомное профилирование молекулярно-генетических систем и процессов

№ гос. регистрации 01201280329                

Блоки:

Изучение воздействия терагерцового излучения на живые объекты в ЦКП «Сибирский центр синхротронного и терагерцового излучения»

Томографический анализ распределения магнитоконтрастных наночастиц при интраназальном, пероральном и ингаляционном введении в организм. Идентификация основных органов-мишеней.

Отработка технологий получения субстрата для микроорганизмов на основе растительной биомассы.

Поиск штаммов и консорциумов микроорганизмов, обладающих высокой физиологической и ферментной активностью с целью создания высокоэффективных микроорганизмов комплексов.

Поиск  и идентификация штаммов микроводорослей, пригодных для использования в качестве продуцентов биомассы и липидов.

Сравнительный анализ реакции мукозального иммунитета легких  на интратрахеальное введение наночастиц у мышей, различающихся преобладанием клеточного и гуморального иммунных ответов.

Экспедиционный грант: Выполнение экспедиционных работ по cбору образцов воды, почвы и донных осадков   пресных и минерализованных озер Новосибирской области и Алтайского края.

Экспедиционный грант: Поиск и сбор растений – альтернативных источников целлюлозы.

3.     Прикладные разработки

Успешно выполнены Государственные контракты в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 – 2013 годы»

Разработанный совместно с ИЯФ и ИХКиГ СО РАН метод мягкой  неразрушающей абляции биополимеров без разрушения их структуры под действием терагерцового излучения Новосибирского лазера на свободных электронах  признан достижением РАН.

Выполнен Государственный контракт № 02.512.11.2068 «Диагностика ДНК-биочипов при помощи терагерцового излучения» (совместно с ИЯФ СО РАН)

В результате разработан метод прямого анализа целевых ДНК биочипов.  Получен патент РФ.

Государственный контракт:  16.513.11.3135

Разработка экспериментального образца биоаналитического комплекса нового поколения на основе микро/нанофлюидных систем

Период выполнения: с 21 октября 2011 г. по 09  сентября 2012 г.

На основе полученных результатов разработано техническое задание на ОКР по теме «Разработка биоаналитического комплекса нового поколения на основе микро/нанофлюидных систем». Получен патент РФ.

Государственный контракт №  14.512.11.0050

Период выполнения: 3 апреля - 20 октября 2013 г.

Создание методов метаболической инженерии термофильных микроорганизмов для получения штаммов-продуцентов молочной кислоты

В результате выполнения проекта получены продуценты молочной кислоты на основе термостабильных штаммов Geobacillus spp., разработан проект Технического задания на выполнение опытно-технологической работы (ОТР) по теме «Масштабирование процесса получения молочной кислоты с применением термостабильных штаммов».

Государственный контракт № 14 512 11 0057

Период выполнения: 3 апреля - 30 сентября 2013 г.

Разработка методов генетической модификации термофильных микроорганизмов с целью создания термоустойчивых штаммов-продуцентов, предназначенных для трансформации сахаров из возобновляемых источников биомассы в биоэтанол

В результате выполнения проекта получены продуценты биоэтанола на основе термостабильных штаммов Geobacillus spp., На основе полученных результатов разработан проект технического задания на проведение прикладной НИР по теме: «Масштабирование процесса получения биоэтанола с применением термостабильных штаммов».

Государственный контракт № 14 512 11 0065 совместно с ИК СО РАН

Период выполнения: 19 апреля - 1 октября 2013 г.

Проведение испытаний разработанных липаз и биоктализаторов на их основе. обобщение и оценка результатов исследования

В результате выполнения проекта создан научно-технический задел для разработки экологически безопасных и конкурентоспособных биокаталитических технологий получения продуктов органического синтеза, разработаны ферменты липазы и биокатализаторы на их основе, характеризующиеся экологической чистотой, для процессов получения ценных пищевых жиров и биотоплива. Разработан проект Технического задания на ОТР по теме "Разработка технологии производства биокатализатора для получения жиров специального назначения" и рекомендации по использованию результатов при масштабировании.

Государственный контракт № 14 512 11 0072

Период выполнения: 19 апреля - 1 октября 2013 г.

Разработка биокаталитических методов превращения биомассы мискантуса в этанол

Разработан проект ТЗ на ОТР по теме «Разработка опытно-промышленной технологии получения биотоплива из возобновляемой растительной биомассы». Подана заявка на изобретение № 2013142988 «Штамм бактерии Esherichia coli EX pQE30, продуцент эндоксиланазы бактерии Geobacillus stearothermophillus 22».

4.     Лучшие результаты

Изучение воздействия  терагерцового излучения на живые объекты

Проведена серия экспериментов облучения клеток геносенсора E.coli/pKatG-gfp терагерцовым излучением Новосибирского лазера на свободных электронах (ЛСЭ, уникальная установка ИЯФ СО РАН, совместные работы), при длинах волн, составляющих 130 мкм, 150 мкм и 200 мкм. На рисунке 1, приведены значения уровня флюоресценции GFP-белка в клетках геносенсора после однократного облучения  терагерцовым излучением с плотностью мощности  1.4 Вт/см2  и длиной волны 130 в течение 15 мин. и уровень флюоресценции GFP-белка в этих же клетках индуцированный перекисью водорода в различных концентрациях (положительный контроль) и базовый уровень флуоресценции в клетках, не подвергавшихся никаким воздействиям (отрицательный контроль).

Аналогичные результаты получены для длин волны излучения 150 мкм и 200 мкм. Результаты однозначно свидетельствуют, что клетки геносенсора E.coli/pKatG-gfp реагируют сходным образом как на присутствие перекиси водорода в различных концентрациях, так и на воздействие терагерцовым излучением. При этом ответ клеток на воздействие терагерцовым излучением хотя и развивается несколько позже, однако характеризуется существенно более высокой интенсивностью флюоресценции.

Протеомный анализ E.coli выявил, что облучение терагерцовым излучением приводит к увеличению экспресии 14 белковых фракций и снижению экспрессии 10 других белковых фракций (рис. 2). Идентификация белков проводили с помощью масс-спетрометрического анализа методами MALDI-TOF и ионно-циклотронного резонанса.

Были идентифицированы следующие белки: Upp (uracil phosphoribosyltransferase), rplY (50S ribosomal subunit protein L25), glnA (glutamine synthetase), manX (Component of mannose PTS permease), rbsA (Component of ribose ABC transporter), GltA (citrate synthase), RpoD (RNA polymerase, sigma 70 (sigma D) factor), Degp (serine protease Do), hlyE (hemolysin E), PurA (adenylosuccinate synthetase), Tsx (receptor of phage T6 and colicin K), cydA (cytochrome bd-I terminal oxidase subunit I), AppC (cytochrome bd-II terminal oxidase subunit I), AspC (aspartate aminotransferase, PLP-dependent).

Биоинформационный анализ промоторных областей генов идентифицированных белков выявил в них сайты связывания транскрипционных факторов, регулирующих стрессовый ответ в клетках, OxyR и MarA.

Комплексная оценка биобезопасности наночастиц различной природы в экспериментах на мышах SPF-статуса: исследования спектра белков бронхо-альвеолярного лаважа.

Разработан комплексный подход, состоящий из способов и методов предварительной оценки и прогнозирования вероятных последствий контакта нано-компонентов с организмом человека и другими живыми объектами. Изучение воспалительных процессов развивающихся после экспозиции наночастицами показало, что однократная интраназальная аппликация наночастиц оксида кремния (таркосил) вызывала статистически значимый прирост общего числа лейкоцитов в составе бронхоальвеолярных лаважей (БАЛ). Методами двумерного электрофореза с последующим масс-спектрометрическим анализом проведена идентификация белков бронхоальвеолярного лаважа, указанных стрелками на рисунке 3.

Анализ протеомных карт БАЛ после развития реакции на наночастицы таркосила свидетельствуют о том, что в ответ на экспозицию мышей наночастицами меняется концентрация не только белков воспалительного ответа, но и концентрация белков, функционально связанных с индукцией апоптоза и регуляцией клеточного цикла.

Идентификация микроорганизмов методами современной геномики и протеомики

В 2011 году в рамках поставленных в проекте задач были продолжены экспедиционные исследования экстремальных экосистем Новосибирской области (место сосредоточения озер с повышенной минерализацией) и Курило-Камчатского вулканического пояса (район активных гидротермальных проявлений). Было отобрано более 200 проб воды, донных осадков и микробных сообществ, проведено пополнение коллекции экстремофильных микроорганизмов. В настоящее время коллекция насчитывает более 1000 культур. Анализ материала, полученного в ходе экспедиционных работ, показал, что доминировали в сообществах соленых озер: в планктоне – археи или бактерии, в бентосе – цианобактерии или нитчатые зеленые водоросли. Доминантами в микробных сообществах Долины гейзеров и кальдеры Узон в зависимости от температуры были: нитчатые серные бактерии Thermotrix sp., аноксигенные фототрофные бактерии Chloroflexus sp., цианобактерии Phormidium spp. и Mastigocladus laminosus и зеленые водоросли. На примере озера Соленое (Новосибирская область) было проведено молекулярно-генетическое исследование микробного сообщества, в результате которого было получено более 200 клонов и проанализировано более 150 последовательностей. Наибольшее количество клонов – 26 - было получено для представителей рода Cymbella (диатомовые водоросли), 17 - для представителей филума Bacteroidetes, 12, 10 и 9 для родов Marinobacter, Desulfosalina и Haloanaerobium соответственно. Уровень сходства полученных последовательностей с имеющимися в базе данных NCBI - 99-85%, что позволяет прогнозировать обнаружение новых таксонов в ранге вида, рода и возможно семейства.

Установление видовой принадлежности культур проводится с помощью молекулярно-биологических методов по гену 16S рРНК. Среди организмов, выделенных из термальных местообитаний, преобладают представители родов Bacillus, Brevibacillus, Anoxybacillus, Geobacillus, Aneurinibacillus. Среди культур, выделенных из высокоминерализованных экосистем, преобладают: Dietzia, Staphylococcus, Bacillus, Paenibacillus, Halomonas, Planococcus, Brevundimonas, Pseudomonas, Haloarcula, Halorubrum, Salicola, Idiomarina, Micrococcus, Arthrobacter, Leclercia. В результате тестирования физиолого-биохимических характеристик ряда термофильных штаммов было показано, что все они хорошо растут на среде с комплексными субстратами, внесенными в качестве единственных источников углерода и энергии. Спектр соединений, утилизируемых штаммами в аэробных и анаэробных условиях, достаточно широк.

С помощью метода флуоресцентной in situ гибридизации была изучена пространственно-временная организация планктонных микробных сообществ соленых озер Новосибирской области и определен количественный состав архей, бактерий, цианобактерий и водорослей. Основными доминантами, ответственными за особенности формирования структуры исследованных микробных сообществ непосредственно в планктоне являлись археи и устойчивые к высоким значениям минерализации бактерии. Распределение разных групп (бактерий, архей и водорослей) в исследуемых озерах было крайне неравномерно.

В 2011 году было продолжено проведение процедуры биотипирования коллекционных штаммов. Работы по оптимизации метода подготовки различных групп микроорганизмов для масс-спектрометрического анализа, позволили получить высокоинформативные и воспроизводимые спектры белковых профилей ряда галофильных и термофильных организмов. Анализ полученных индивидуальных белковых профилей позволяет оценить степень сходства/отличия исследуемых организмов (рис. 4). 

Рисунок 4. MALDI масс-спектры термофильных микроорганизмов: а – Anoxybacillus flavithermus, б - Anoxybacillus pushchinoensis, в – Geobacillus stearothermophilus-13, г -Geobacillus stearothermophilus-27 (расширение по оси Х, m/z)

На примере термофильных Anoxybacillus и Geobacillus проиллюстрирована степень сходства/отличия между представителями разных видов одного рода (рис 4, а, б), представителями одного вида (рис. 4, в, г) и представителями разных родов (рис. 4). Продолжается формирование базы данных белковых профилей экстремофильных микроорганизмов.

В программе BioTyper был проведен биоинформационный анализ базы данных для более чем 50 штаммов (рис. 5). 

Рисунок 5. Филогенетическое дерево, построенное на основании данных MALDI-TOF масс-спектрометрии для галофильных и термофильных микроорганизмов. 

Регистрация микроорганизмов, способных к биоаккумуляции отдельных химических элементов, на основе комбинации методов FISH и РФА-СИ (совместно с ИЯФ СО РАН)

Проведен анализ химических элементов, ассоциированных с микробными сообществами, основанный на корреляции изображений в оптической и рентгеновской областях. Впервые получены совмещенные изображения, позволяющие проводить элементный анализ микроорганизмов. 

Рисунок 6

Совместно с сотрудниками ИЯФ СО РАН отработаны методики получение оптических и рентгеновских изображений природных образцов микробных сообществ различных термальных зон (Курило-Камчатский вулканический пояс, Байкальская рифтовая зона), обработка рентгеновских изображений, совмещение изображений, полученных в оптической и рентгеновской областях и анализ полученных карт.

Поддержание коллекции микроорганизмов и выделение новых штаммов

Проведено выделение новых штаммов и пополнение коллекции экстремофильных микроорганизмов ИЦиГ СО РАН. Установлено филогенетическое положение ряда штаммов, проведена их фенотипическая характеризация. В результате выявлен и подробно описан штамм, являющийся новый видом термофильных бактерий Geobacillus icigianus sp. nov.

Данный штамм (шифр G1w1) выделен из водной пробы высокотемпературного выхода (97 ⁰С), находящегося в районе гейзера Тройного (долина Гейзеров). Установлено, что по последовательностям гена 16S рРНК и гена spo0A этот штамм относится к роду Geobacillus, однако он далек от всех ранее описанных видов этого рода.

Для данного штамма проведено полногеномное секвенирование и подробная морфологическая, биохимическая, генетическая и филопротеомная характеристика, что позволило описать его как новый вид Geobacillus icigianus sp. nov.

Колонии и клетки исследуемого штамма типичны для представителей рода Geobacillus. Однако анализ биохимических характеристик штамма G1w1 показал его достоверное отличие от остальных видов рода Geobacillus. Для исследуемого штамма была получена серия из 36
единичных спектров, из которых был сгенерирован
характеристический суперспектр для занесения в базу данных.
Установлено, что штамм G1w1 отличается от остальных штаммов Geobacillus spp., имеющихся в базе данных ИЦиГ СО РАН, наличием пиков с массами 2211,8, 2227,8, 2574,4, 2587, 2887,1, 4553, 6897,6, 7454 Да.

Филогенетическое дерево, построенное на основании последовательностей 16S рРНК типовых штаммов рода Geobacillus, а также наиболее близких к исследуемому штамму последовательностей, взятых из базы данных GenBank, не позволил отнести штамм G1w1 к какому-либо известному виду рода Geobacillus.

Рисунок 7

Хотя для ряда штаммов, относящихся к роду Geobacillus, известны полные геномные последовательности, молекулярная характеристика этого рода ограничивается использованием последовательностей 16S рРНК, так как для большинства типовых штаммов данных о других последовательностях в настоящее время не существует.

Поэтому для более точной идентификации данного штамма был использован ген spo0A, который в настоящее время является единственным геном, по последовательностям которого имеются данные для значительного количества видов рода Geobacillus. Полученное филогенетическое дерево, построенное на основании последовательностей гена spo0A, иллюстрируют то, что штамм G1w1 заметно отстоит от всех других представителей рода.

Таким образом, можно заключить, что выделенный штамм относится к роду Geobacillus, но заметно отличается от всех видов этого рода по биохимическим и молекулярно-генетическим признакам, что является основанием для выделения его в новый вид, которому было присвоено низание Geobacillus icigianus sp. nov.

Проведенные исследования позволяют предположить наличие в созданной коллекции ИЦиГ СО РАН целого ряда новых таксонов видового и родового ранга.

Комплексное исследование динамики белкового состава клеток меристемы пшеницы в ответ на яровизацию

Основным генетическим фактором, инициирующим цветение пшениц, является система генов Vrn. Получение информации о функционировании этой системы в процессе яровизации растений на молекулярном уровне является важной задачей, решение которой позволит управлять процессом развития растений. Методами молекулярной генетики показано отсутствие экпрессии гена Vrn1 у озимых образцов без яровизации, тогда как у яровых образцов ген экпрессируется.

Для проведения протеомного анализа апробирована методика выделения суммарного белка из листьев Triticum boeticum, выбраны оптимальные условия экстракции, подобран состав буфер для регидратации.

Поиск, селекция и изучение перспективных бактериальных штаммов-продуцентов для переработки глицерина (совместно с ИЯФ СО РАН)

Проведен метагеномный анализ суммарной ДНК образцов, отобранных в геотермальном источнике Термофильный (полуостров Камчатка) и озера Кротовая Ляга (Новосибирская область). Анализ последовательности ДНК позволил найти гены, потенциально пригодные для совершенствования штаммов микроорганизмов, осуществляющих биоконверсию глицерина в ценные химические вещества (в том числе, 1,3-пропандиол).

В результате исследования геотермальных источников Камчатки были обнаружены микроорганизмы, способные использовать глицерин в качестве единственного источника углерода.

1) Clostridium cellulosi - 0.3%, представляющий собой строгий анаэроб, гетеротроф, не способный к сульфат-редукции. Оптимум его роста наблюдается при нейтральных значениях рН и температуре 55-60°С.

2) Eubacterium sp.- составлявший 0.1% от всех последовательностей. Кроме того, данные бактерии были обнаружены в цианобоктериальном мате горячих источников Елоустонского парка США.

3) Clostridium symbiosum: - 0.1% от всех последовательностей.

4) Desulfotomaculum geothermicum strain DSM 3669: - 0.1% последовательностей. Представляют собой строгие анаэробы, гетеротрофные, водород-окисляющие, сульфат- редукторы.

Рисунок 8. Представленность таксонов микрорганизмов, обнаруживаемых в источнике Термальный по данным метагеномного анализа. А. - точка У-5-3.

Таким образом, содержащиеся в образцах термофильные бактерии Clostridium cellulosi и Clostridium symbiosum могут быть выделены и использованы как потенциальные объекты для создания рекомбинантных микроорганизмов, перерабатывающих глицерин. Найдены варианты генов, кодирующих фермент глицерин дегидрогеназа (EC 1.1.1.6), отвечающий за способность бактерий использовать глицерин в качестве источника энергии. Таким образом, была создан банк метагеномной ДНК, предназначенный для выделения как бактерий, так и целевых генов.

 5.     Задачи, планируемые на перспективу

• Геномно-протеомное профилирование стрессового ответа клеток E. coli на воздействие терагерцовым излучением.
• Исследование кохезин-докериновых систем экстремофильных микроорганизмов.
• Изучение нетермического воздействия терагерового излучения на вторичную структуру ДНК.
• Разработка научных основ процессов микробной деградации углеводородов.
• Эволюция геномов при неополиплоидии у животных.
• Характеристика штаммов коллекции микроорганизмов ИЦиГ СО РАН.
• Изучение биоразнообразия природных микробных сообществ, поиск перспективных штаммов.
• Исследование механизмов ассимиляции растительной биомассы целлюлозолитическими бактериями.
• Создание технологий переработки микроорганизмами возобновляемых растительных ресурсов с целью получения высококачественной целлюлозы, исходных органических веществ для крупнотоннажного химического производства и производства биотоплива (Биотех2030).