1.     Основное направление фундаментальных и фундаментально-ориентированных исследований  

Изучение краткосрочных и долгосрочных эффектов при воздействии in vitro на преимплантационные зародыши животных; применение репродуктивных технологий с целью сохранения генетических ресурсов различных видов млекопитающих.

2.     Задачи, решаемые в настоящее время в рамках базового бюджетного проекта VI.53.2.1«Иммуногенетические механизмы межорганизменных взаимодействий в репродуктивном цикле млекопитающих как фактор изменчивости потомков»

Блок, за выполнение которого отвечает сектор:

“Долговременные эффекты воздействия in vitro на преимплантационные зародыши и гаметы: криоконсервация, экстракорпорального оплодотворение, длительное и кратковременное культивирование”.

3.     Прикладные разработки

Прикладные разработки сектора ведутся по двум прикладным программам:

Программа 1: Редеривация уникальных линий крыс и мышей селекции ИЦиГ СО РАН.

Эта программа важна для всего института. В ходе выполнения этой программы при помощи методов репродуктивной биологии (криоконсервация, культивирование, трансплантация эмбрионов и другие) были редеривированы уникальные линии крыс, такие как НИСАГ (две сублинии), ГК, OXYS. Дополнительно к этому основному списку была редеривирована линия Вистар. Была проведена проверка статуса редеривированных крыс и подтверждено, что они соответствуют SPF стандартам. Наряду с редеривацией крыс в настоящее время активно проходит редеривация уникальных линий мышей в результате трансплантации эмбрионов мыши четырех различных генотипов. Активно продолжаются работы и с редеривацией других линий мышей.

Программа 2: Создание Российского криобанка эмбрионов и гамет лабораторных животных.

 Эта программа важна не только для ИЦиГ СО РАН, но и в целом для Российской Федерации, так как это, фактически, первый подобный банк генетических ресурсов на территории РФ. В настоящее время в криобанке хранится в криоконсервированном состоянии в общей сложности более 4000 эмбрионов полученных от разных линий мышей и крыс. Таким образом, генетические ресурсы 35-ти линий лабораторных животных представлены в криобанке созданном благодаря практическим усилиям сотрудников сектора криоконсервации и репродуктивных технологий. 

4.     Иллюстрированное описание лучших результатов, полученных подразделением за последние 5 лет

Постановка проблемы (rationale).  

В мире существует по разным оценкам от 5049 до 5400 видов млекопитающих, причем по данным  IUCN, около  20 % (около 1100 видов) имеют статус угрожаемый или исчезающий. Одним из важнейших способов сохранения исчезающих видов на сегодняшний день является криобанк эмбрионов  и гамет. Успешная криоконсервация эмбрионов каждого нового вида является  большим достижением. Проблема состоит в том, что для получения живого потомства из замороженных эмбрионов исчезающих видов приходится прибегать к межвидовой трансплантации. Как возможный способ преодоления межвидового репродуктивного барьера нами ранее был предложен способ получения гибридов с близкородственным ему видом млекопитающих, после чего можно было бы трансплантировать такого рода гибридам эмбрионы target species.

Задача: Замораживание, криоконсервация, культивирование in vitro и трансплантация эмбрионов рода Phodopus c преодолением межвидового репродуктивного барьера

Этап 1. Поскольку эмбрионы хомячков рода Phodopus до настоящего эксперимента не замораживали, на первом этапе работы были подобраны оптимальные условия замораживания-размораживания. В качестве критерия оценки жизнеспособности после криоконсервации был использован метод двойного окрашивания флуорохромами: FDA (fluorescein diacetate, Sigma) and PI (propidium iodide, Sigma) c последующей оценкой на микроскопе M205 FA (Leica microststems, Германия).

Эмбрионы хомячка Кэмпбелла были заморожены, криоконсервированы и разморожены тремя различными способами (Рис. 1).Наиболее эффективным оказался способ CRYO-3: замораживание по классической программе с использованием этиленгликоля и сахарозы в качестве криопротектора и медленном размораживании (Рис.2). 

Рисунок 1. Эмбрионы  хомячка Кэмпбелла, подвергавшиеся замораживанию и криоконсервации и контрольные (не подвергавшиеся этим процедурам), исследованные при помощи световой и флуоресцентной микроскопии на микроскопе M205 FA (Leica microststems, Германия).

Белыми стрелками показаны мертвые бластомеры. Темные стрелки указывают нарушения оболочек.

Верхний ряд – световая микроскопия

Нижний ряд –флуоресцентная микроскопия (окраска двумя флуорохромами: FDA/PI)

Зеленое свечение – живые клетки. Красное – мертвые клетки

 (a, b) – контрольная группа;

 (c, d) - эмбрионы замороженные «стандартным» способом с ЭГ и размороженные «быстрым» способом;

(e, f) Эмбрионы замороженные «стандартным» способом с ЭГ и размороженные «медленным» способом;

(g, h) Эмбрионы замороженные «стандартным» способом с ЭГ+сахароза и размороженные «медленным» способом;

Масштабная полоска = 100 микрон. 

Рисунок 2.

Этап 2. На втором этапе были получены межвидовые гибриды при скрещивании хомячков Джунгарского и Кэмпбелла

Этап 3. Криоконсервация, размораживание, культивирование in vitro и трансплантация эмбрионов Джунгарского хомячка межвидовым гибридам

Эмбрионы хомячка Джунгарского были заморожены и разморожены по системе Cryo3 (Рис. 3А). После культивирования в течение 24 часов in vitro в среде R1ECM  (rat 1-cell embryo culture medium) в условиях CO2 инкубатора (Binder, Германия) при 37 ºC и CO2 5 %, они развились и пять эмбрионов достигли стадии морулы (Рис.3 Б). 

Рисунок 3. Эмбрионы Джунгарского хомячка до трансплантации реципиенту

(масштабная полоска = 100 микрон).

А- после процедур замораживания и размораживания

Б – они же после культивирования in vitro в течение 24 часов

Все шесть эмбрионов после криоконсервации и культивирования in vitro в течение 24 часов были трансплантированы гибридной самке- реципиенту полученной на этапе 2. Было зарегистрировано рождение трех детенышей (Рис. 4). Генетического анализа проведенный в ИПЭЭ РАН (г. Москва) подтвердил, что эти детеныши развились именно из трансплантированных эмбрионов и имеют гаплотип депонированный в Генбанке под номером JN014997 (рис.5).

Рисунок 4. Реципиент с одним из трех потомков - трансплантантов. 

Рисунок 5.  Гаплотипы Джунгарских хомячков (Phodopus sungorus) представленных Генбанке ИПЭЭ РАН (n=41). Гаплотип трех родившихся детенышей помечен звездочкой.

5.     Задачи, планируемые на перспективу

Фундаментальные научные задачи.

Фундаментальной научной задачей, на которую будут направлены усилия сектора в ближайшей перспективе, это изучение краткосрочных и долгосрочных эффектов воздействия на преимплантационные эмбрионы гипертензивных (линия НИСАГ) и склонных к каталепсии (линия ГК) крыс в условиях их развития in vitro. В частности, будут изучены отдаленные эффекты на проявления соответствующей патологии при воздействии ростовыми факторами на стадии преимплантационного эмбриона.

Фундаментально- прикладные задачи:

Сектор имеет опыт создания криобанков эмбрионов и гамет с целью консервации генетических ресурсов лабораторных животных. Кроме того, при выполнении проектов на видах семейства куньих и при выполнении текущего проекта на хомячках рода Phodopus, была сформирована рабочая гипотеза о путях преодоления  межвидового репродуктивного барьера и перспективных направлениях создания криобанка генетических ресурсов исчезающих видов млекопитающих. В перспективе планируется применение этой концепции к представителям семейства кошачьих. При этом будут не только получены уникальные знания по репродуктивной биологии и эмбриологии видов Felidae, но и разработаны оригинальные подходы к сохранению некоторых диких видов этого семейства. Сотрудники сектора прошли стажировку в отделе репродуктивной биологии Leibniz Institute for Zoo and Wildlife Research (Берлин, Германия), который является лидером в Европе (и одним из лидеров в мире) в применении репродуктивно-биологических и криобиологических подходов к сохранению диких видов кошек. Планируется в ближайшей перспективе активно заниматься этим важным направлением.

Совместители