1.     Основное направление исследований

Изучение молекулярных механизмов генетической предрасположенности к наследственным заболеваниям человека, вызванным регуляторными SNPs.

2.     Задачи, решаемые в настоящее время

Главной проблемой в выявлении и анализе потенциально функциональных регуляторных SNPs является отсутствие точных и экспериментально верифицированных компьютерных методов. Для решения этой проблемы нами проводится комплексное экспериментально-компьютерное изучение SNPs (SNP - single nucleotide polymorphism) ТАТА-боксов и их влияния на взаимодействие ТВР (ТВР - TATA-binding protein). Задачей данного этапа является широкогеномный поиск неаннотированных полиморфизмов ТАТА-бокса - одного из основных промоторных элементов белок-кодирующих генов человека, и их комплексное экспериментальное исследование с целью выявления потенциально функционально значимых.

3.      Прикладные разработки

Прикладных разработок нет

4.      Иллюстрированное описание лучших результатов, полученных подразделением за последние 5 лет

Известно, что в результате секвенирования генома человека, обнаружено огромное количество SNPs (SNP – single nucleotide polymorphism), фенотипические проявления которых неизвестны.  Главной проблемой в выявлении и анализе потенциально функциональных регуляторных SNPs является отсутствие точных и экспериментально верифицированных компьютерных методов. Для решения этой проблемы нами проводится комплексное экспериментально-компьютерное изучение SNPs ТАТА-боксов и их влияния на взаимодействие ТВР (ТВР - TATA-binding protein). На основании наших экспериментальных данных и компьютерного изучения взаимодействия ТВР/ТАТА, под руководством М.П. Пономаренко выведено уравнение связывания ТВР с ТАТА-боксами  за три последовательных шага: скольжение ТВР вдоль ДНК  в силу неспецифического сродства между ними  ↔ опознавание ТАТА-бокса ↔ стабилизация комплекса ТВР/ТАТА в результате эндотермической перестройки:                                                                                                       

С его помощью было проанализировано взаимодействие ТВР с ТАТА-боксами промоторов генов человека, содержащими SNPs, ассоциированные с рядом заболеваний, и сделан прогноз in silico изменения аффинности ТВР к ним. Экспериментальная верификация с использованием метода EMSA в максимально стандартизированных условиях показала, что экспериментальные данные с высокой достоверностью коррелируют с прогнозами (Табл.): коэффициенты линейной корреляции, r = 0.822 для  значений равновесных K_D  (-ln K_D) и   r = 0.785  для  изменения равновесных K_D (δ)  при содержании SNPs в ТАТА-боксах (δ =    -Ln[K_D,ТАТА Mut] –(-Ln[K_D,ТАТА]),   при значимости   α<10^-7  и α<10^-3 , соответственно. Эксперименты также показали, что SNPs, ассоциированные с повышенным риском возникновения таких заболеваний человека, как α-, β- и δ-талассемии, инфаркт миокарда, тромбофлебит, рак легких и др., вызывают изменение сродства ТВР/ТАТА (K_D) в основном в 2 - 4 раза (Табл.), согласующееся известными из литературы уменьшением содержания  мРНК и белка in vivo и  in vitro. Впервые полученные кинетические характеристики комплексов ТВР c аллельными вариантами ТАТА-боксов показали, что SNPs приводят к уменьшению скоростей образования hТВР/ТАТА от 2.5 до 55 раз. Скорости диссоциации, характеризующие прочность комплексов, снижаются значительно в меньшей степени - от ~10% до 1.6 раз. Не наблюдается корреляции между прочностью комплексов hТВР/ТАТА и скоростью их образования. Времена полураспада комплексов hТВР/ТАТА здоровых людей изменяются от 6.6. мин до 14.5 мин, а при SNPs, ассоциированных с наследственными заболеваниями – от 6 мин до 54 мин.

Таблица.  Экспериментальная верификация прогнозов изменения сродства (KD) ТВР человека к ТАТА-боксам дикого типа и при содержании SNPs, ассоциированных с повышенным риском возникновения наследственных патологий.

Используя флуоресцентно меченые Cy3 и Cy5 дуплексы, идентичные ТАТА-боксу промотора гена TPI дикого типа и содержащего SNP, и методы FRET и остановленной струи (спектрометр SX20, Applied Photophysics, UK), мы впервые показали, что в режиме реального времени связывание ТВР/ТАТА происходит в течение 10 сек и механизм описывается одностадийной кинетической моделью. В первые секунды взаимодействия ТВР связывает и одновременно изгибает ДНК ТАТА-бокса промотора гена TPI дикого типа при меньших концентрациях ТВР, чем при содержании в ТАТА-боксе SNP -24Т>G, ассоциированного с неврологическими и мышечными нарушениями, кардиомиопатией и др. заболеваниями. 

Результаты проводимых исследований улучшат понимание молекулярных механизмов полиморфного разнообразия регуляции экспрессии генов и механизма связывания ТВР/ДНК. Комплексный анализ регуляторных SNPs позволит получить оценки их влияния на здоровье человека, чувствительность к лекарствам и условиям окружающей среды.

5.     Задачи, планируемые на перспективу

Высокие значения коэффициентов линейной корреляции прогноз/эксперимент позволяют говорить о применимости  выведенного уравнения равновесного связывания  ТВР/ТАТА для анализа неаннотированных SNPs  ТАТА-боксов,  предсказания изменения сродства ТВР к ТАТА-боксам, содержащим такие SNPs, и  выявления  среди них потенциально  функционально значимых. На основании полученных характеристик взаимодействия ТВР/ТАТА, изучения влияния SNPs на экспрессию репортерного гена будут сделаны предположительные прогнозы фенотипического проявления SNPs. Решению этих задач посвящены наши дальнейшие исследования.

Бывшие сотрудники

Совместители

Публикации

2011	Разработка методов распознования сайтов связывания транскрипционных факторов FoxA, их экспериментальная верификация и использование для анализа данных массовой иммунопреципитации хроматина Левицкий В. Г., Ощепков Д. Ю., Ершов Н. И., Брызгалов Л. О., Антонцева Е. В., Васильев Г. В., Меркулова Т. И., Колчанов Н. А. Doklady Akademii Nauk, 2011, Т. 436, № 3, - С.417-421.
	Analysis of Data on Large Scale Chromatin Immunoprecipitation by Recognition of Transcription Factor Binding Sites VG Levitskii, GV Vasil’ev, DYu Oshchepkov, NI Ershov, and TI Merkulova Russian Journal of Genetics: Applied Research, 2011, V. 1, N. 3, P. 173–182
	Изменение сродства ТАТА-связывающего белка к олигонуклеотидам, соответствующим ТАТА-боксам промоторов генов человека, несущим полиморфизмы, ассоциированные с наследственными заболеваниями Драчкова И.А., Аршинова Т.В., Пономаренко П.М., Меркулова Т.И., Савинкова Л.К., Колчанов Н.А. Vavilov journal of genetics and breeding, 2011, № 3, т. 15, стр. 439-447
	In vitro examining the existing prognoses how TBP binds to TATA with SNP associated with human diseases Drachkova I.A., Ponomarenko P.M., Arshinova T.V., Ponomarenko M.P., Suslov V.V., Savinkova L.K., Kolchanov N.A. Health, 2011, 3, 9, 577-583
2010	Полиморфизмы ТАТА-боксов генов хозяйственно важных и лабораторных животных и растений, ассоциированные с их селекционно-ценными признаками Суслов В.В., Пономаренко П.М, Пономаренко М.П, Драчкова И.А., Аршинова Т.В.,Савинкова Л.К., Колчанов Н.А. RUSS J GENET+, 2010, 4, 46, 448-457
	Точное уравнение равновесия для четырех шагов связывания ТВР с ТАТА-боксом для предсказания фенотипической экспрессии при мутациях Пономаренко П.М., Суслов В.В.,Савинкова Л.К., Пономаренко М.П.,Колчанов Н.А. BIOPHYSICS, 2010, 3, 55, 400-414
	SNPs in the HIV-1 and HIV-2 TATA Box and the AIDS pandemic Suslov V.V., Ponomarenko M.P., Savinkova L.K., Ponomarenko P.M., Efimov V.M., Kolchanov N.A. Journal of Bioinformatics and Computational Biology, 2010, 3, 8, 607-625.
	Анализ результатов эксперимента по массовой иммунопреципитации хроматина с помощью методов распознавания сайтов связывания транскрипционных факторов Левицкий В.Г., Васильев Г.В., Ощепков Д.Ю., Ершов Н.И., Меркулова Т.И. Информационный вестник ВОГИС, 2010, Т. 14, № 4, С. 685–697
	Влияние полиморфизмов ТАТА-бокса промотора гена бета-глобина человека, ассоциированный с бета-талассемией, на взаимодействие ТАТА-связывающего белка Драчкова И.А., Аршинова Т.В., Пономаренко П.М., Меркулова Т.И., Колчанов Н.А., Савинкова Л.К. Информационный вестник ВОГИС, 2010, т.14, с. 698-705
2009	Полиморфизмы ТАТА-боксов промоторов генов человека и ассоциированные с ними наследственные патологии Cавинкова Л.К., Пономаренко М.П., Пономаренко П.М., Драчкова И.А., Лысова М.В., Аршинова Т.В., Колчанов Н.А. BIOCHEMISTRY-MOSCOW+, 2009, 2, 74, 149-163
	Предсказание влияния полиморфных замен нуклеотидов в ТАТА-боксах промоторов генов человека на сродство к ним ТАТА-связывающего белка Пономаренко М.П., Пономаренко П.М., Драчкова И.А., Лысова М.В., Аршинова Т.В.,Савинкова Л.К.,Колчанов Н.А. Molecular Biology, 2009, 3, 43, 512-520
	Изменения транскриптома печени крысы под действием гепатоканцерогенного для этих животных 3МЕДАБ и неканцерогенного ОАТ Н.И. Ершов, В.Г. Левицкий, Д.Ю. Ощепков, О.В. Вишневский, Л.О. Брызгалов, Е.В. Антонцева, Т.И. Меркулова. Информационный вестник ВОГИС, 2009, Т. 13, № 4, С. 703–722
2008	Пошаговая модель связывания ТВР/ТАТА бокс позволяет предсказать наследственные заболевания человека по точечным полиморфизмам Пономаренко П.М., Савинкова Л.К., Драчкова И.А., Лысова М.В., Аршинова Т.В., Пономаренко М.П., Колчанов Н.А. Doklady Biochemistry and Biophysics, 2008, 6, 419, 828-832
	Увеличенное взаимодействие белка ядерных экстрактов перевиваемых опухолей печени и легких мышей с ТАТА-содержащим олигонуклеотидом Лысова М.В., Аршинова Т.В., Драчкова И.А., Кобзев В.Ф., Каледин В.И., Савинкова Л.К. B EXP BIOL MED+, 2008, Т. 145, № 1, стр.100-102
	Выявление генов-мишеней транскрипционных факторов FOXA, связанных с регуляцией пролиферации Брызгалов Л.О., Ершов Н.И., Ощепков Д.Ю., Каледин В.И., Меркулова Т.И. BIOCHEMISTRY-MOSCOW+, 2008, Вып. 1, Том 73: 70-75
	Изучение возможности реверсии устойчивости к хлорохину верапамилом у Plasmodium berghei - возбудителя малярии грызунов Панкова ТГ., Игонина ТМ., Майер ТВ., Рабинович СА., Максакоская ЕВ., Морозов ЕН Медицинская паразитология и паразитарные болезни, 2008, №4, 19-22
2007	Исследование связывания ядерных белков штаммов P.berghei, различающихся по чувствительности к хлорохину, с олигонуклеотидами, соответствующими регуляторным элементам гена множественной лекарственной устойчивости Панкова Т.Г., Т.М. Игонина, В.Ф. Кобзев, Т.И. Меркулова. Биомедицинская химия, 2007, т. 53. 547-556
	Взаимодействие рекомбинантного ТАТА-связывающего белка с ТАТА-боксами промоторов генов млекопитающих Савинкова Л.К., Драчкова И.А., Пономаренко М.П., Лысова М.В., Аршинова Т.В., Колчанов Н.А. Экологическая генетика, 2007, Т.V, №2, 44-49
2006	Различия в связывании ядерных белков из отличающи хся по устойчивости к хлорохину штаммов P.berghei с олигонуклеотидами, соответствующими регуляторным элементам mdr1 гена Панкова Т.Г., Игонина Т.М., Кобзев В.Ф., Меркулова Т.И. B EXP BIOL MED+, 2006, т.141, N 3, с.283-286.
	An effect of the microsporidian Vairimorpha ephestiae (Microsporidia: Burenellidae) on activity and spectrum of nonspecific esterases in different tissues of the greater wax moth galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) larvae Vorontsova Ia.L., Ershov N.I., Glupov V.V. Паразитология, 2006, 40(1): 74-84

Конференции

2011	Влияние полиморфизмов ТАТА-боксов, ассоциированных с наследственными заболеваниями человека, на взаимодействие с hТВР Драчкова И.А.. Савинкова Л.К., Аршинова Т.В., Пономаренко П.М., Пономаренко М.П., Колчанов Н.А. II-nd International conference Physico-Chemical Biology dedicated to the 85th anniversary of academician Dmitri G. Knorre.
	Анализ данных массовой иммунопреципитации хроматина с помощью экспериментально верифицированных методов распознавания сайтов связывания транскрипционных факторов FoxA Ощепков Д. Ю., Левицкий В. Г. , Кулаковский И. В., Ершов Н. И., Васильев Г.В., Меркулова Т. И. II международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика»
2010	prognosis and verification of the TATA SNP effects V.V. Suslov, P.M. Ponomarenko, M.P. Ponomarenko, L.K. Savinkova, I.A. Drachkova, N.A. Kolchanov Crimean meeting. IIIrd International conference, deducated to N.W. Timofeeff-Ressovsky "Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution". Alushta, 9-14 october, 2010
	SNPs in the hiv-1 TATA box and the aids pandemic V.V. Suslov, P.M. Ponomarenko, V.M. Efimov, M.P. Ponomarenko, L.K. Savinkova, N.A. Kolchanov Crimean meeting. IIIrd International conference, deducated to N.W. Timofeeff-Ressovsky "Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution". Alushta, 9-14 october, 2010
	ТАТА-боксы вносят вклад в норму реакции Суслов В.В., Пономаренко М.П., Пономаренко П.М., Савинкова Л.К., Драчкова И.А. Международная научно-практическая конференция "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" 23-26 ноября, 2010, г. Санкт-Петербург
	SNP ТАТА-бокса ВИЧ-1 и пандемия СПИД Суслов В.В., Пономаренко П.М., Пономаренко М.П., Ефимов В.М., Савинкова Л.К., Колчанов Н.А. Проблемы экологии. Чтения памяти проф. М.М.Кожова. Иркутск, 2010
	SNPs IN THE HIV-1 TATA BOX AND THE AIDS PANDEMIC V.V. Suslov, P.M. Ponomarenko, V.M. Efimov, M.P. Ponomarenko, L.K. Savinkova, N.A. Kolchanov (6) IIIrd International conference, deducated to N.W. Timofeeff-Ressovsky Crimean meeting."Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution".
	«Прогноз и экспериментальная проверка изменения сродства ТВР к ТАТА-боксам промотров генов человека, содержащим полиморфизмы». – Драчкова ИА., Пономаренко РМ., Пономаренко МП., Аршинова ТВ., Савинкова ЛК., Колчанов НА. «Первые Международные Беккеровские чтения» (27-29 мая 2010)
	Experimental verification of the prognosis human TBP/TATA affinity change as a result of polymorphisms associated with hereditary pathologies I.A. Drachkova., P.M. Ponomarenko., T.V. Arshinova., M.P. Ponomarenko., L.K. Savinkova., N.A. Kolchanov. BGRS
2008	the precise equilibrium equation of TBP/TATA-binding predicts human familial diseases upon mutations Ponomarenko P.M., Savinkova L.K., Drachkova I.A., Lysova M.V., Arshinova T.V., Ponomarenko M.P., Kolchanov N.A. 6th international conference on bioinformatics of genome regulation and structure BGRS’2008, Novosibirsk, June 22-28
	Транскрипционные факторы FOXA как потенциальные опухолевые супрессоры в печени Т.И. Меркулова, Л.О. Брызгалов, Н.И. Ершов, Д.Ю. Ощепков, М.Ю. Пахарукова, К.Ю. Кропачев, В.И. Каледин Всероссийская конференция "Молекулярная онкология", г. Новосибирск
	Транскрипционные факторы FOXA как потенциальные опухолевые супрессоры в печени Т.И. Меркулова, Л.О. Брызгалов, Н.И. Ершов, Д.Ю. Ощепков, М.Ю. Пахарукова, К.Ю. Кропачев, В.И. Каледин. Всероссийская конференция с международным участием "Молекулярная онкология"
2007	ПОВЫШЕННАЯ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ TATA-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА В ЭКСТРАКТАХ ЯДЕР ПЕРЕВИВАЕМЫХ ОПУХОЛЕЙ ПЕЧЕНИ И ЛЕГКОГО МЫШЕЙ Лысова М.В., Аршинова Т.В., Драчкова И.А., Каледин В.И., Савинкова Л.К. II Cъезд Общества клеточной биологии совместно с Юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН. Санкт-Петербург, 16 - 19 октября 2007
2006	Взаимодействие белков транскрипционного комплекса РНК-полимеразы II с олигорибонуклеотидами Драчкова И.А., Репкова М.Н., Лысова М.В., Аршинова Т.В., Савинкова Л.К. Международная конференция "Физико-химическая биология", посвященная 80-летию со дня рождения академика Д.Г. Кнорре. Новосибирск, июль 2006

Гранты

2010	Молекулярные механизмы стресс-специфического контроля экспрессии генов животных Министерство образования и науки Российской Федерации, номер гранта 02.740.11. 0705
2009	Биоинформатика генетической изменчивости: исследование влияния мутаций на молекулярно-генетические системы организмов Президиум РАН, номер гранта 23.29