1.     Основное направление исследований

Изучение молекулярных механизмов генетической предрасположенности к наследственным заболеваниям человека, вызванным регуляторными SNPs.

2.     Задачи, решаемые в настоящее время

Главной проблемой в выявлении и анализе потенциально функциональных регуляторных SNPs является отсутствие точных и экспериментально верифицированных компьютерных методов. Для решения этой проблемы нами проводится комплексное экспериментально-компьютерное изучение SNPs (SNP - single nucleotide polymorphism) ТАТА-боксов и их влияния на взаимодействие ТВР (ТВР - TATA-binding protein). Задачей данного этапа является широкогеномный поиск неаннотированных полиморфизмов ТАТА-бокса - одного из основных промоторных элементов белок-кодирующих генов человека, и их комплексное экспериментальное исследование с целью выявления потенциально функционально значимых.

3.      Прикладные разработки

Прикладных разработок нет

4.      Иллюстрированное описание лучших результатов, полученных подразделением за последние 5 лет

Известно, что в результате секвенирования генома человека, обнаружено огромное количество SNPs (SNP – single nucleotide polymorphism), фенотипические проявления которых неизвестны.  Главной проблемой в выявлении и анализе потенциально функциональных регуляторных SNPs является отсутствие точных и экспериментально верифицированных компьютерных методов. Для решения этой проблемы нами проводится комплексное экспериментально-компьютерное изучение SNPs ТАТА-боксов и их влияния на взаимодействие ТВР (ТВР - TATA-binding protein). На основании наших экспериментальных данных и компьютерного изучения взаимодействия ТВР/ТАТА, под руководством М.П. Пономаренко выведено уравнение связывания ТВР с ТАТА-боксами  за три последовательных шага: скольжение ТВР вдоль ДНК  в силу неспецифического сродства между ними  ↔ опознавание ТАТА-бокса ↔ стабилизация комплекса ТВР/ТАТА в результате эндотермической перестройки:                                                                                                       

С его помощью было проанализировано взаимодействие ТВР с ТАТА-боксами промоторов генов человека, содержащими SNPs, ассоциированные с рядом заболеваний, и сделан прогноз in silico изменения аффинности ТВР к ним. Экспериментальная верификация с использованием метода EMSA в максимально стандартизированных условиях показала, что экспериментальные данные с высокой достоверностью коррелируют с прогнозами (Табл.): коэффициенты линейной корреляции, r = 0.822 для  значений равновесных K_D  (-ln K_D) и   r = 0.785  для  изменения равновесных K_D (δ)  при содержании SNPs в ТАТА-боксах (δ =    -Ln[K_D,ТАТА Mut] –(-Ln[K_D,ТАТА]),   при значимости   α<10^-7  и α<10^-3 , соответственно. Эксперименты также показали, что SNPs, ассоциированные с повышенным риском возникновения таких заболеваний человека, как α-, β- и δ-талассемии, инфаркт миокарда, тромбофлебит, рак легких и др., вызывают изменение сродства ТВР/ТАТА (K_D) в основном в 2 - 4 раза (Табл.), согласующееся известными из литературы уменьшением содержания  мРНК и белка in vivo и  in vitro. Впервые полученные кинетические характеристики комплексов ТВР c аллельными вариантами ТАТА-боксов показали, что SNPs приводят к уменьшению скоростей образования hТВР/ТАТА от 2.5 до 55 раз. Скорости диссоциации, характеризующие прочность комплексов, снижаются значительно в меньшей степени - от ~10% до 1.6 раз. Не наблюдается корреляции между прочностью комплексов hТВР/ТАТА и скоростью их образования. Времена полураспада комплексов hТВР/ТАТА здоровых людей изменяются от 6.6. мин до 14.5 мин, а при SNPs, ассоциированных с наследственными заболеваниями – от 6 мин до 54 мин.

Таблица.  Экспериментальная верификация прогнозов изменения сродства (KD) ТВР человека к ТАТА-боксам дикого типа и при содержании SNPs, ассоциированных с повышенным риском возникновения наследственных патологий.

Используя флуоресцентно меченые Cy3 и Cy5 дуплексы, идентичные ТАТА-боксу промотора гена TPI дикого типа и содержащего SNP, и методы FRET и остановленной струи (спектрометр SX20, Applied Photophysics, UK), мы впервые показали, что в режиме реального времени связывание ТВР/ТАТА происходит в течение 10 сек и механизм описывается одностадийной кинетической моделью. В первые секунды взаимодействия ТВР связывает и одновременно изгибает ДНК ТАТА-бокса промотора гена TPI дикого типа при меньших концентрациях ТВР, чем при содержании в ТАТА-боксе SNP -24Т>G, ассоциированного с неврологическими и мышечными нарушениями, кардиомиопатией и др. заболеваниями. 

Результаты проводимых исследований улучшат понимание молекулярных механизмов полиморфного разнообразия регуляции экспрессии генов и механизма связывания ТВР/ДНК. Комплексный анализ регуляторных SNPs позволит получить оценки их влияния на здоровье человека, чувствительность к лекарствам и условиям окружающей среды.

5.     Задачи, планируемые на перспективу

Высокие значения коэффициентов линейной корреляции прогноз/эксперимент позволяют говорить о применимости  выведенного уравнения равновесного связывания  ТВР/ТАТА для анализа неаннотированных SNPs  ТАТА-боксов,  предсказания изменения сродства ТВР к ТАТА-боксам, содержащим такие SNPs, и  выявления  среди них потенциально  функционально значимых. На основании полученных характеристик взаимодействия ТВР/ТАТА, изучения влияния SNPs на экспрессию репортерного гена будут сделаны предположительные прогнозы фенотипического проявления SNPs. Решению этих задач посвящены наши дальнейшие исследования.