1.     Основное направление исследований

• Механизмы процесса инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих
• Эмбриональные и региональные стволовые клетки
• Репрограммирование дифференцированных соматических клеток к плюрипотентному состоянию

2.     Задачи, решаемые в рамках основного направления на данном этапе:

1. Исследование динамики изменений, происходящих в смысловой и антисмысловой транскрипции, модификациях хроматина, локализации и частоте использования ориджинов репликации ДНК и связывании транскрипционных факторов в центре инактивации обыкновенных полевок.
2. Импринтированная инактивация Х-хромосомы у грызунов: модификации хроматина и природа импринтинга.
3. Разработка и применение эффективных методов получения региональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных клеток для генетической и клеточной терапии заболеваний человека.
4.  Создание панели изогенных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, несущих мутации, связанные с развитием различных форм амиотрофического бокового склероза.
5. Поиск подходов к коррекции мутантного фенотипа крыс Браттлборо с наследственным несахарным диабетом посредством применения плюрипотентных клеток с искусственно исправленным генотипом.
6. Разработка подходов для тканевой инженерии сосудов.

Аннотация базового бюджетного проекта подразделения

Бюджетный проект VI.60.2 «Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Экспериментальное использование клеточных технологий для воспроизводства и коррекции патологических состояний» (координатор проекта: д.б.н. проф. С.М.Закиян). 

Цель проекта – создание клеточных моделей для моделирования и коррекции заболеваний человека, а также исследование статуса Х-хромосомы в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках.

3.     При наличии прикладных результатов (что желательно) должен быть введен еще один раздел «Прикладные разработки».

Прикладных разработок нет.

4.     Иллюстрированное описание лучших результатов, полученных подразделением за последние 5 лет  

Впервые получены трофобластные стволовые (ТС) клеточные линии обыкновенной полевки в отсутствие фактора FGF4.

Из бластоцист обыкновенной полевки M.rossiaemeridionalis с использованием полевочьего фактора LIF, ингибирующего дифференцировку, и питающего (фидерного) слоя клеток, в отсутствие фактора FGF4 были получены три независимые ТС клеточные линии. Полевочьи ТС клетки похожи на мышиные по морфологии, по экспрессии генов транскрипционных факторов, по способности при дифференцировке in vitro давать производные трофэктодермальной зародышевой линии, по способности инвазировать и разрушать ткани хозяина с образованием героррагических опухолей после инъекции ТС клеток мышам nude (рис.1). В полевочьих ТС клетках наблюдается импринтированная инактивация отцовской Х-хромосомы, что характерно для трофобластной зародышевой линии. Было показано, что у мыши фактор FGF4 и его рецептор FGFR2 являются эмбриональными сигнальными факторами, ответственными за поддержание недифференцированного состояния мультипотентных ТС клеток. Наши данные говорят о возможности существования другого сигнального пути, ответственного за установление и стабильную пролиферацию полевочьих ТС клеток.

Рисунок 1. Образование опухоли после инъекции ТС клеток полевки в мышь nude. (А) Общий вид опухоли. (B-D) Гистологические срезы гематомы. Окрашивание гематоксилином-эозином. (В) Поперечный срез центральной части гематомы через 35 дней после инъекции. (С) Увеличенное изображение отмеченного участка опухоли на рис.B; гистологический срез гематомы через кровеносный капилляр (D). (А) зона некроза, (В) пролиферирующие клетки, (С) гигантские клетки, (С₁) дифференцирующиеся гигантские клетки, (C₂) дегенерирующие гигантские клетки, (T_R) ткани реципиента, (V) кровеносный сосуд.

Изучено распределение модификаций хроматина на неактивной Х-хромосоме у обыкновенной полевки.

Проведено сравнение распределения некоторых гистоновых модификаций на метафазных пластинках клеток экстраэмбриональной эндодермы и фибробластов полевки M.rossiaemeridionalis, которые являются примерами импринтированной и случайной инактивации Х-хромосомы. Х-хромосома M.rossiaemeridionalis несет большой блок конститутивного гетерохроматина, обогащенный повторяющейся ДНК, что делает данный вид хорошей моделью для изучения структуры хроматина. В фибробластах полевки и в большинстве клеток экстраэмбриональной эндодермы в молчание неактивной Х-хромосомы, по-видимому, включено два типа факультативного гетерохроматина (рис.2). Первый обогащен триметилированием H3K27 и убиквитинированием H2A и солокализуется с бэндингом Xist РНК, тогда как второй тип гетерохроматина связан с триметилированием H3K9 и гетерохроматиновым белком HP1. Блок конститутивного гетерохроматина на Х-хромосоме M.rossiaemeridionalis имеет такой же распределение модификаций, как и второй тип факультативного хроматина. Распределение гистоновых модификаций, белка HP1 и Xist РНК на неактивной Х-хромосоме полевки одинаково в случае импринтированной и случайной инактивации Х-хромосомы.

Рисунок 2. Два типа факультативного гетерохроматина на неактивной Х-хромосоме в XEN клетках M.rossiaemeridionalis.a H3K27me3 (зеленый). b H3K9me3 (зеленый). с HP1ß (зеленый) и FK2 (красный). Метафазные пластинки окрашены DAPI (синий). Активная (X_a) и неактивная (X_i) Х-хромосомы показаны головками стрелок и стрелками соответственно. d Распределение HP1ß на активной и неактивной хромосомах. e Увеличенное изображение неактивной Х-хромосомы с линейным сканированием интенсивности DAPI (синий), HP1ß (зеленый) и FK2 (красный).

Обнаружено, что у грызунов основным репрессором гена Xist (ключевого гена процесса инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих) является транскрипция антисмыслового гена Tsix.

Известно, что у мыши регуляция ключевого гена центра инактивации Xist, запускающего процесс инактивации Х-хромосомы, во многом зависит от транскрипции окружающих его некодирующих ядерных РНК Enox, Tsix, Xite (Lee et al., 1999, 2001, 2010). В данной работе восстановлена полная картина экзон-интронной структуры и границ транскриптов в ближайшем окружении гена Xist у полевки и крысы, и проведено сравнение с аналогичными данными, полученными на мыши (Рис. 3А). Установлено, что у полевок и крысы значительно изменены экзон-интронная структура, промоторные районы, точки старта и терминации транскрипции ядерной РНК Enox, а также отсутствует транскрипция, соответствующая регуляторному элементу Xite, которые у мыши играют важную роль в регуляции гена Xist. Показано, что основной промотор, структура и паттерн экспрессии гена Tsix консервативны у полевки, крысы и мыши, что позволяет предполагать его основную роль в регуляции гена Xist у грызунов. Показано, что большая часть РНК гена Tsix полевки и крысы, также как и у мыши, не подвергается сплайсингу (Рис. 3Б) и, вероятно, осуществляет репрессию гена Xist за счет транскрипции в районе его промотора.

Рисунок 3. (А) Экзон-интронная структура и границы некодирующих ядерных РНК (Enox, Xist, Tsix, Xite) и белок-кодирующих генов (Lrrrn, Slc7a3) в центре инактивации Х-хромосомы у грызунов: мыши, крысы и полевки. (Б) Нозерн-блот анализ паттерна экспрессии гена Tsix у тринадцатидневных эмбрионов полевки и крысы.

Впервые показано, что экспрессия гена Xist, инициирующего процесс инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих, находится под контролем гормона эстрогена.

В промоторе гена Xist, обнаружены консервативные сайты связывания эстрогенового рецептора. В экспериментах с использованием люциферазных конструкций, содержащих промоторную область гена Xist мыши, показано, что при индукции эстрадиолом экспрессия репортерного гена статистически значимо усиливается в дифференцированных соматическим клетках и не изменяется в эмбриональных стволовых клетках (Рис.4). Полученные результаты позволяют заключить, что экспрессия гена Xist может находиться под влиянием эстрогена в момент запуска процесса инактивации.

Получены доказательства, что импринтированная инактивация Х-хромосомы у самок млекопитающих имеет происхождения от процесса мейотического сайленсинга половых хромосом в сперматогенезе.

Показано, что у мыши и полевки неактивная структура Х-хромосомы на постмейотических стадиях развития в сперматогенезе самцов и на ранних этапах процесса импринтированной инактивации Х-хромосомы в эмбриогенезе самок обеспечивается.

Рисунок 4. Влияние эстрадиола (E2) на активность промотора гена Xist в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК) и фибробластах. На схеме отмечены границы двух репортерных конструкций 12 и 3 (зелеными скобками), расположение консервативных сайтов рецептора эстрогена (ER), старта транскрипции гена Xist и района минимального промотора (P min). На гистограммах отражена относительная люциферазная активность репортерных конструкций 12 и 3 в эмбриональных стволовых клетках и фибробластах мыши, обработанных (+E2) и необработанных эстрадиолом.

Рисунок 5. Сходство модификаций хроматина, используемых при инактивации Х и Y-хромосом в мейотической инактивации (А, Б) и на ранних стадиях импринированной инактивации Х-хромосомы в TS-клетках мыши(В) и полевки (Г). HP1, H3K9me3 – модификации неактивного хроматина. Стрелкой показаны неактивные Х-хромосомы.

Единой системой сайленсинга: HP1/3meH3K9. Единство спектра и паттерна модификаций хроматина на постмейотических стадиях сперматогенеза и на ранних этапах импринтированной инактивации Х-хромосомы свидетельствуют в пользу того, что половой хроматин в сперматогенезе и инактивация Х-хромосомы на ранних этапах импринтированной инактивации могут осуществляться за счет сходных механизмов, и подтверждает предположение о том, что мейотическая инактивация может представлять собой исходный механизм импринтированной инактивации Х-хромосомы.

Впервые показано, что в репрессии гена Xist на активной Х-хромосоме принимает участие фактор CTCF, который связывается с его промоторной областью и играет роль инсулятора.

В инактивации гена Xist на активной Х-хромосоме принимает участие фактор CTCF, который связывается с промоторной областью и играет роль инсулятора (рис.6). Консервативный сайт связывания фактора CTCF выявляется в 5' районе гена Xist у грызунов и человека, что свидетельствует об его функциональной значимости.

Рисунок 6. CTCF взаимодействует с промотором гена Xist на активной X-хромосоме.

Показано, что механизмы и динамика процесса импринтированной инактивации Х-хромосомы в предымплантационном развитии у грызунов имеют значительные видоспецифические отличия.

Обнаружены существенные отличия в составе и картине распределения репрессивных модификаций хроматина в процессе импринтированной инактивации Х-хромосомы у полевки и мыши (рис.9). Эти данные свидетельствуют о значительном разнообразии механизмов регуляции процесса импринтированной инактивации и свидетельствуют о различных потребностях в дозовой компенсации генов Х-хромосомы на ранних стадиях эмбрионального развития у грызунов. 

Рисунок 7. Видоспецифические особенности хроматина неактивной Х-хромосомы при импринтированной инактивации на предимплантационных стадиях развития у полевки M. levis. Иммунофлуоресцентное окрашивание модификаций неактивного хроматина (H3K9me3 – зеленый и H3K27me3 - серый) совместно с РНК FISH (Xist РНК – красный) на стадии бластоцисты.

Разработан эффективный протокол направленной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека в предшественники васкулярных клеток.

Для этого предложено проводить направленное получение васкулярных предшественников, дифференцируя плюрипотентные клетки в монослое на культуральной поверхности, обработанной коллагеном четвертого типа.

Рисунок 8. Направленная дифференцировка плюрипотентных клеток человека в предшественники васкулярных клеток и далее их дифференцировка в эндотелиальные и гладкомышечные клетки. Полученные дифференцированные производные экспрессируют характерные поверхностные (CD31, CD34, PDGFRα, CD146) антигены, выявляемые с помощью проточной цитофлуориметрии и флуоресцентного окрашивания. 

Рисунок 9. Оценка функциональности эндотелиальных клеток. Эндотелиальные клетки (CD31, vWF) нарабатывают компоненты внеклеточного матрикса: фибронектин, коллаген, эластин (А), и поглощают ацетилированную форму липопротеина низкой плотности (Б).

Рисунок 10. Пролиферация эндотелиальных клеток на различных типах матриксов, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. А – эндотелиальные клетки, меченные красителем митохондрий (красный), пролиферирующие на поверхности децеллюляризированого скэфолда сосуда человека (зеленый), окрашенного антителами к фибронектину; Б – эндотелиальные клетки на поверхности из поликапролактона, покрытого коллагеном 4 типа, окраска антителами к коллагену 1 типа (красный) и фибронектину (зеленый); В – эндотелиальные клетки на поверхности из лавсана, покрытого желатином, окраска антителами к CD31(зеленый), коллагену 1 типа (красный) и фибронектину (желтый), справа – распределение активно пролиферирующих клеток, окраска митохондриальным красителем TMRM (красный).

Разработка высокоэффективных технологий получения индуцированных плюрипотентных клеток (ИПСК) человека без генетической модификации геномов клеток.

Показано, что полноценные ИПСК человека можно получить из фетальных нейральных стволовых клеток с помощью временной сверхэкспрессии гена OCT4 без интеграции плазмидной ДНК в геном клетки. Было обнаружено, что репрограммирование ФНСК, имеющих набор половых хромосом ХХ, не сопровождается эпигенетической реактивацией неактивной Х-хромосомы.

Рисунок 11. Иммуноцитохимический анализ клеток полученных в результате дифференцировки ИПСК in vitro. Синий цвет – окраска ядер клеток красителем DAPI, зеленый цвет - окраска клеток с помощью антител к коллагену I (А), β-III-тубулину (Б), фибронектину (В), цитокератину 18 (Г), транскрипционному фактору GATA6 (Д) и нестину (Е). Иммуноцитохимический анализ показал, что полученные в результате выполнения проекта ИПСК являются плюрипотентными, то есть, способны дифференцироваться в производные всех трех примитивных зародышевых листков.

5.     Задачи, планируемые на перспективу: 

• Создание и исследование изогенной модели бокового амиотрофического склероза, на основе плюрипотентных клеток человека, несущих миссенс-мутации в гене SOD1;
• Изучение эффективности и безопасности коррекции мутантного фенотипа крыс линии Браттлеборо с помощью плюрипотентных клеток с отредактированным генотипом;
• Создание и исследование изогенной модели болезни Паркинсона с ранним началом, на основе плюрипотентных клеток человека несущих делецию третьего экзона гена PARKIN (PARK2);
• Эпигенетический и транскрипционный статус Х-хромосомы человека в плюрипотентных стволовых клетках и их дифференцированных производных;
• Создание и использование клеточных моделей для сравнительного анализа процесса нейродегенерации при наследственной и спорадической форме болезни Альцгеймера.

Совместители