1.     Основные направления исследований

Изучение структурно-функциональной организация генетического материала на уровне генома, хромосом и генов. Реконструкция генома, трансгенез у животных и растений.

Изучение ультраструктурной организации живых систем.

Задачи, решаемые в рамках основного направления на данном этапе:

1. 1. Выяснение принципов молекулярной и пространственной организации хромосом эукариот;
   2. Анализ формирования и ультраструктурной организации клеточных структур;
   3. Разработка новых методов микроскопического и молекулярно-генетического анализа;
   4. Обеспечение работы Центра коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов СО РАН (создан приказом директора института в соответствии с Постановлением Президиума СО РАН № 387 от 01.11.2001).
   5. Обеспечение работы Центра коллективного пользования ИЦиГ СО РАН по проточной цитофлуорометрии (создан приказом директора института №33-А от 3 июля 2006г).

2.     Аннотация базового бюджетного проекта подразделения

Проект: VI.53.1.4. Молекулярная и функциональная организация и эволюция хромосом эукариот (№ гос. Регистрации 01201280325).

В рамках программы бюджетного проекта проводятся исследования, посвященные как пространственной организации геномов эукариот, так и выяснению закономерностей и механизмов их эволюции. К настоящему времени получено детальное описание хромосом описторхид (Zadesenets et al., 2012 a,b,c). Описаны особенности реорганизации теломерных и ядрышкообразующих районов хромосом саранчовых (Jetybaev  et al., 2012). Проведен анализ организации теломерных районов эукариот (Жданова  с соавт., 2012). Выполнен анализ особенностей рекомбинации хромосомных районов у животных гетерозиготных по хромосомным перестройкам (Torgasheva et al., 2013). Описаны хромосомные перестройки в эмбриональных стволовых клетках человека (Karamysheva et al., 2013). Разработаны новые методы анализа внеклеточной ДНК (Morozkin et al., 2012) и выявления хромосомоспецифичных сигналов при проведении FISH микродиссекционных ДНК-проб с метафазными хромосомами (Богомолов с соавт., 2012).

3.     Прикладные разработки

Разработаны и совершенствуются методы молекулярно-цитогенетического анализа хромосомных перестроек человека. Разработан метод определения состава аномальной хромосомы с помощью создания из нее микродиссекционной ДНК пробы и последующей FISH с прометафазными хромосомами человека. В стадии разработки находится метод более чем на порядок повышающий разрешающую способность молекулярно-цитогенетической диагностики хромосомных патологий. В отличие от большинства современных методов молекулярно-цитогенетического анализа разрабатываемая технология должна позволять проведение описания аномальных хромосом, даже в случае их присутствия в небольшом числе клеток пациента. Метод предполагает массовое параллельное секвенирование микродиссекционных ДНК-библиотек и последующий биоинформатический анализ полученных данных. Примером проведения такого анализа является описание состава маркерной хромосомы и определения точки разрыва-воссоединения, которые имели место при ее формировании, на базе полученной ДНК-библиотеки: Была подготовлена ДНК-проба и проведена супрессионная гибридизация in situ с метафазными хромосомами пациента (Рис. 1). В результате анализа FISH маркерная хромосома была описана как inv dup(15)(q13). В качестве контроля в пилотном исследовании использовали микродиссекционную ДНК-библиотеку длинного плеча 15-й хромосомы человека. Для ее создания использовали тот же протокол, который был использован для создания ДНК-библиотек маркерной хромосомы. Оценка качества ДНК-пробы 15q было выполнено с помощью FISH с метафазными хромосомами человека ДНК-пробы, приготовленной на ее основе. ДНК-библиотека была приготовлена из 15q, та как 15р состоит, главным образом, из повторенных последовательностей ДНК. В современных версиях генома человека информация о последовательностях р-плеча хромосомы 15 и ее прицентромерного гетерохроматина отсутствует. Проведено секвенирование ДНК микродиссекционных библиотек (ДНК библиотеки маркерной хромосомы и q-плеча хромосомы 15). Секвенирование выполнено на приборе массового параллельного секвенирования Ion Torrent PGM. Выполнен биоинформатический анализ последовательностей ДНК микродиссекционных библиотек. Показано, что глубина покрытия, полученная секвенированием даже на одном 314 чипе, дает существенное повышение точности локализации точек разрыва по сравнению с FISH. На рисунке 2 четко видна граница района, соответствующего ДНК маркерной хромосомы.

Анализ распределения уникальных последовательностей из микродиссекционных ДНК библиотек выявил два протяженных участка хромосомы (chr15:30400000-31000000 (15q.13.2) и chr15:32,400000-33000000 (q13.3)), в которых практически отсутствовали уникальные последовательности ДНК (Рис. 2, овал). Возможно, наличие этих участков обусловлено обогащением их повторенными последовательностями. Биоинформатический анализ этих гэпов выявил их соответствие горячим точкам хромосомных перестроек хромосомы 15. Необходимо отметить, что, наряду с обогащением этих районов повторенными последовательностями ДНК, в них находятся и уникальные последовательности, например: гены: ULK4P3, CHRFAM7A, ULK4P1, ULK4P2 (q13.2); FLJ43588, ULK4P3 (q13.3). Если возникновение гэпов являнтся результатом снижением в этих районах доли уникальных последовательностей, проблема дальнейшего повышения точности в локализации точки разрыва может быть решена увеличением глубины секвенирования ДНК микродиссекционных библиотек. Однако, биоинформатический анализ этих районов дает основание предположить наличие в них особой, упаковки хроматина. На это указывает низкая представленность в них Chip-Seq данных консорциума ENCODE по гистоновым модификациям (Рис. 3; сравнительно бледный фон следов иммунопреципитации в районе гэпа). Для этих районов также характерна низкая концентрация сайтов гиперчувствительности к ДНКазе (DHS, Dnase Hypersensitive Sites; рис. 3), копии псевдогена ULK4 (unc-51-like kinase). Могут ли особенности организации хроматина этих районов привести к изменению представленности ДНК этих районов в микродиссекционных ДНК-библиотеках предстоит выянить.

Таким образом, к настоящему времени определены основные проблемы, которые необходимо решить в ходе разработки данной технологии, также выявлены особенностей в организации районов горячих точек хромосомных перестроек.

Рисунок 1. FISH микродиссекционной ДНК-пробы, полученной из сверхчисленной маркерной хромосомы. Окрашены (зеленый сигнал) маркерная хромосома и соответствующие районы хромосомы 15. Стрелка указывает на маркерную хромосому.

Рисунок 2. Локализация фрагментов ДНК из микродиссекционных ДНК-библиотек q-плеча хромосомы 15 (зеленый) и сверхчисленной маркерной хромосомы (красный) в q-плече хромосомы 15 человека. На оси Х показано положение последовательностей, соответствующих фрагментам ДНК микродиссекционных ДНК-библиотек на части q-плеча хромосомы 15, на оси Y – число соответствующих фрагментов. Внизу приведена схема бэндов хромосомы 15. Овалом обведен один из гэпов в распределении покрытия на границе определяемой области. Трек был построен с помощью ucsc браузера (www.genome.ucsc.edu). 

Рисунок 3. Локализация фрагментов ДНК из микродиссекционных ДНК-библиотек q-плеча хромосомы 15 (зеленый) и сверхчисленной маркерной хромосомы (красный) в проксимальном районе q-плеча хромосомы 15 человека. В распределении фрагментов из микродиссекционных ДНК-библиотек q-плеча хромосомы 15 (зеленый) виден район гэпа (отсутствия фрагментов ДНК из микродиссекционных ДНК-библиотек), соответствующий поз. chr15:32,465,149-32,925,701) – району локализации точки разрыва, имевшей место при возникновении маркерной хромосомы. Ниже для данного района хромосомы приведены данные о локализации генов (БД REfSeq), по распределению гиперчувствительных кластеров сайтов рестрикции ДНКазы (построенные по 112 клеточных линиям консорциума ENCODE), по распределению гиперчувствительных кластеров сайтов рестрикции ДНКазы (построенные по дополнительным 74 клеточным линиям консорциумом ENCODE), по распределению кластеров гистоновых модификаций, полученных методом Chip-Seq консорциумом ENCODE.

4.     Иллюстрированное описание лучших результатов, полученных подразделением за последние 5 лет

Эволюция ДНК прицентромерного гетерохроматина у лесных мышей

Проведён анализ гомологии последовательностей ДНК, составляющих прицентромерные районы хромосом и прицентромерный гетерохроматин, у генетически наиболее удалённых видов лесных мышей (видов рода Apodemus по отношению друг к другу, а также к видам рода Sylvaemus). При кросс-гибридизации ДНК-проб, полученных из прицентромерных С-сегментов особей видов Sylvaemus, c хромосомами представителей видов Apodemus (Рис. 4), а также ДНК-проб, полученных из прицентромерных С-блоков особей видов Apodemus, с хромосомами экземпляров видов Apodemus и Sylvaemus, наблюдались единичные FISH-сигналы, как правило – на границе прицентромерных С-позитивных и С-негативных районов гетерохромосом и аутосом одной из самых крупных пар, в дистальных участках длинных плеч некоторых аутосом, либо диффузная флуоресценция почти по всей длине хромосом кроме собственно прицентромерных районов.

Данные результаты свидетельствуют о снижении гомологии повторённых последовательностей ДНК, составляющих прицентромерные районы хромосом, при увеличении степени дифференциации и уменьшении родства сравниваемых форм и видов лесных мышей (то есть при переходе от конспецифичных популяций и внутривидовых форм к аллопатричным и «хорошим» видам Sylvaemus, а затем – к далёким видам). Наряду с вырождением ДНК-повторов, по-видимому, происходит постепенное разрушение их кластеров и замена новыми, негомологичными последовательностями во всех или почти всех прицентромерных районах (с возможным «вытеснением» небольшой части прежних последовательностей в интеркалярные или теломерные районы хромосом); этот процесс, отмеченный уже при сравнении некоторых видов Sylvaemus, у далёких видов лесных мышей достиг практически завершающей стадии.

Рисунок 4. Многоцветная FISH трёх микродиссекционных ДНК-проб, полученных из прицентромерных районов хромосом S. sylvaticus ( зелёный сигнал), S. flavicollis (жёлтый сигнал) и S. ponticus (красный сигнал) с метафазными хромосомами  A. agrarius. Окраска хромосом DAPI (синий сигнал).

Молекулярно-цитогенетический анализ хромосом описторхид

Проведен цитогенетический и молекулярно-цитогенетический анализ хромосом пяти видов описторхид: Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884), Opisthorchis viverrini (Poirier, 1886), Metorchis xanthosomus (Creplin, 1846), Metorchis bilis (Braun, 1890), Clonorchis sinensis (Cobbold, 1875), включающий анализ локализации и размера С-позитивных районов хромосом, Ag-NOR-окрашивание, локализацию рДНК, кластеров теломерных повторов, выявления кластеров хромосомоспецифичных повторов, сравнительный анализ распределения гомологичных повторенных последовательностей в хромосомах изучаемых видов.

В связи с малым размером генома и хромосом описторхид были разработаны методы получения и работы с пахитенными хромосомами, позволившие значительно увеличить уровень разрешения и чувствительности цитогенетического анализа. Выявлены и локализованы дополнительные С-позитивные районы хромосом, уточнена локализация рДНК, кластером теломерных повторов. Проведенный анализ результатов двухцветной FISH хромосомоспецифичных ДНК-проб с пахитенными хромосомами показал наличие сегментного принципа организации хромосом описторхид (рис. 5).

Рисунок 5. Двухцветная FISH хромосомоспецифичных ДНК-проб  хромосомы 1  и 2 Opisthorchis felineus с пахитенными хромосомами этого вида. а) окраска хромосом красителем DAPI; b) сигналы FISH ДНК-проба  хромосомы 1 (зеленый сигнал) и ДНК-проба  хромосомы 2 (красный сигнал)

Редактирование генома стволовых клеток

Редактирование генома линии стволовых клеток с помощью TALEN технологии для последующего создания новой трансгенной линии мышей (сектор клеточных технологий, к.б.н. К.Е. Орищенко) (рис. 6).

Рисунок 6. Редактирование генома линии стволовых клеток с помощью TALEN технологии.

Внутриядерные актин-миозин-содержащие филаменты

Впервые продемонстрировано участие внутриядерного миозина М1и актина в биогенезе прерибосомных субъединиц, а также их транспорт  по внутриядерным актин-миозин-содержащим филаментам из ядрышка к ядерным поровым комплексам (Obrdlik et al., Fazeb J., 2010). Полученные  данные в совокупности с результатами молекулярно-биологических исследований свидетельствуют об участии миозина в биогенезе рибосом и транспорте пре-рибосомных субъединиц из ядрышка к ядерным порам и далее в цитоплазму. Исследования проводились совместно со шведскими учеными из Каролинского Института в г. Стокгольм. (Рис.7)

Рисунок 7. В ядре ооцитов амфибий на внутриядерных актин-содержащих филаментах (А-В, указаны стрелками), контактирующих с ядрышком (Б), и баскет структурах ядерных пор (Г, указаны стрелками) выявлен миозин NM1 (локализация антител к миозину отмечена красными точками). Предложена модель  взаимодействия миозина  NМ1 (зеленый цвет)    с рРНК,     субъединицами рибосом и внутриядерными филаментами (PLF) (Д).

Внутриклеточный симбионт Wolbachia у Drosophila melanogaster

Впервые установлено тесное взаимодействие внутриклеточного симбионта Wolbachia с мРНК, возможно с участием РНК-связывающих белков, гена gurken у Drosophila melanogaster. Мутация этого гена снижает в 2 раза титр бактерий Wolbachia в питающих клетках яичника мух. Впервые, с использованием электронной микроскопии  установлен механизм подобного действия. Причиной является недостаток мембранных компонентов, необходимых для формирования наружной мембраны вокруг делящихся бактерий, что блокирует конечные этапы их деления (Serbus et al., J.Cell Sci., 2011). Исследования проводились совместно с американскими учеными из Калифорнийского университета в г. Санта-Круз. (Рис.8).

Рисунок 8. Связь между экспрессией гена grk (gurken), кодирующего один из осевых детерминант  D.melanogaster и титром эндосимбионта Wolbachia в питающих клетках яичника. А - представлена типичная морфология бактерии в клетках насекомого с нормальной экспрессией гена gurken, Б-Г - сдвоенные бактерии в результате нарушения расхождения дочерних бактерий в клетках насекомого со сниженной экспрессией grk. Д - гипотетическая модель, демонстрирующая взаимодействие бактерий Wolbachia с геном grk в оогенезе дрозофилы. 

Впервые продемонстрировано различное действие двух штаммов Wolbachia: wMel и wMelPop на процесс оогенеза у D.melanogaster.  Патогенный штамм Wolbachia wMelPop увеличивает частоту апоптоза в клетках гермария яичника дрозофилы и снижает продолжительность жизни мух, в то время как штамм wMel не оказывает подобного действия (Zhukova MV and Kiseleva E., BMC Microbiol., 2012). (Рис.9).

Рисунок 9. Присутствие патогенного штамма Wolbachia wMelPop в клетках гермария (А-Б) яичника  D.melanogaster   увеличивает число апоптирующих цист (В,Г, TUNEL-метод, флуоресцентная микроскопия) и гибель мух. Д,Е- отсутствие метки в клетках  яичника неинфицированных мух.  Предложена модель (Ж) возможного механизма негативного действия бактерий на оогенез дрозофилы путем ингибирования дифференцировки ооцита (З), либо нарушения правильного соотношения фолликулярных и питающих клеток (И), вследствие апоптоза. (Zhukova & Kiseleva, BMC Microbiol., 2012).

5.     Задачи, планируемые на перспективу: формулировки должны содержать как фундаментальные научные задачи, так и возможную прикладную направленность исследований в подразделении.

• Разработка методов получения микродиссекционных ДНК-библиотек, содержащих транскрибируемых последовательностей ДНК, ДНК-библиотек, обогащенных уникальными последовательностями ДНК.
• Отработка методы секвенирования ДНК микродиссекционных ДНК-библиотек в варианте NGS.
• Определение последовательностей ДНК индивидуальных районов хромосом и В-хромосом ряда видов млекопитающих и саранчовых.
• Биоинформатический анализ последовательностей ДНК, вовлеченных в исследование хромосом и хромосомных районов.
• Изучение эволюции ДНК С-позитивных районов эукариот.
• Изучение принципов 3-х мерной организации интерфазного ядра млекопитающих.
• Получение стволовых клеток млекопитающих с редактированным геномом.
• Изучение особенностей взаимодействия эндосимбиотической бактерии Wolbachia с организмом D.melanogaster.

Бывшие сотрудники

Совместители