1.     Основное направление исследований

Получение и характеристика трансгенных клеточных культур и линий животных для изучения процессов нейрогенеза. Создание систем направленного редактирования митохондриального генома млекопитающих. 

Задачи, решаемые в рамках основного направления на данном этапе:

1. Создание трансгенных линий эмбриональных стволовых клеток мыши, в геном которых строго специфично интегрированы репортерные гены флуоресцентных белков, маркирующие экспрессию нейральных генов. Получение химерных животных с маркированной экспрессией нейральных генов инъекционным методом.
2. Разработка и сборка генетических конструкций для специфичной модификации митохондриального генома. Разработка методов доставки генетических конструкций и/или их продуктов в митохондрии. Оценка эффективности доставки генетических конструкций в митохондрии. Характеристика эффективности разработанной системы.

2.     Аннотация базового бюджетного проекта подразделения

Сектор клеточных технологий был создан в январе 2014 г. Основное направление исследований является новым и пока не вошло ни в один бюджетный проект в связи с тем, что эти проекты формировались в конце 2013 года, когда сектор еще не существовал.

3.     Прикладные разработки

В секторе ведется разработка систем направленного редактирования митохондриального генома млекопитающих. Данные системы после их разработки, апробации на модельных животных и прохождении доклинических испытаний, могут быть использованы для генной и клеточной терапии митохондриальных заболеваний. Трудности применения разрабатываемых систем для генной и клеточной терапии связаны с отсутствием законодательной базы в области клеточных технологий в РФ.

4.     Иллюстрированное описание лучших результатов, полученных подразделением за последние 5 лет

Получены трансгенные линии ЭС клеток, в которых экспрессию гена бета-тубулина III (нейрального маркера) можно детектировать по флуоресценции репортерного гена EGFP.

Ген бета-тубулина III (Tubb3), был выбран в качестве маркера нейральной дифференцировки. На первом этапе работы была получена и охарактеризована линия эмбриональных стволовых (ЭС) клеток мыши. Эти клетки имели диплоидное модальное число хромосом и при инъекции в бластоцисту давали вклад во все три зародышевых листка и в зародышевый путь. Для маркирования экспрессии гена Tubb3 при помощи метода направленной модификации генома TALEN (Transcription activator-like effector nuclease) в 3`UTR этого гена вместо стоп-кодона была введена кассета P2A-EGFP-PGK-Puro-PA. Таким образом, экспрессию бета-тубулина III можно детектировать по флуоресценции репортерного гена EGFP. После трансфекции ЭС клеток и селекции на пуромицине были получены 18 трансгенных линий клеток. Молекулярный анализ показал встройку трансгена в целевом месте Tubb3 в четырех линиях ЭС клеток. Проверку функциональности трансгена проводили с помощью дифференцировки ЭС клеток в нейральные клетки с использованием стандартного протокола. На 13 день дифференцировки в телах и отростках клеток детектировали экспрессию EGFP. Дифференцировку в нейроны также подтвердили иммуноцитохимическим окрашиванием на специфический компонент промежуточных микрофиламентов нейронов – NF200 (рис. 1). Таким образом, были получены линии трансгенных ЭС клеток, содержащие кассету P2A-EGFP-PGK-Puro-PA в 3`UTR гена Tubb3, что позволяет использовать их для изучения процессов нейральной дифференцировки и трансдифференцировки.

Рисунок 1. Иммунофлуоресцентное окрашивание нейральных клеток полученных в результате дифференцировки трансгенной линии ЭС клеток мыши.

Разработан дизайн генетической конструкции, кодирующей нуклеазу для внесения направленного специфического одно/двуцепочечного разрыва в геноме митохондрий.

Болезни, обусловленные нарушениями в структуре митохондриальной ДНК (мтДНК), представлены широким спектром заболеваний, распределенных по различным нозологическим группам. Общая численность описанных на сегодняшний день в научной литературе болезней митохондриальной этиологии приближается к 400. В настоящее время отсутствуют эффективные способы направленной модификации митохондриального генома в связи с чем данное направление является актуальным и перспективным. Для того чтобы создать систему направленной модификации митохондриального генома на первом этапе была разработана структура генетической конструкции необходимой для внесения разрыва в мтДНК. Карта конструкции представлена на рисунке 2. Данная конструкция содержит ген нуклеазы Cas9 с нуклеотидной последовательностью адаптированной для экспрессии в клетках человека. В 5`-области гена Cas9 располагается «сильный» промотор – CMV и энхансер для активации экспрессии. Также в этой области находятся последовательности митохондриальной локализации (MTS) и 3хFLAG, которые необходимы для доставки Cas9 нуклеазы в митохондрии и её иммунофлуоресцентной детекции, соответственно. В 3`-области Cas9 располагается ген флуоресцентного белка TurboGFP и после него последовательность из 3`-нетранслируемой области гена SOD2, которая необходима для локализации мРНК, образующейся в процессе транскрипции с данной конструкции, рядом с внешней мембраной митохондрий. Такая локализация будет способствовать более эффективному проникновению нуклеазы Cas9 внутрь митохондрий. Помимо этого, разработанная генетическая конструкция содержит вспомогательные элементы для её наработки в бактериях. Разработка данной конструкции позволяет приступить к созданию и характеристике системы для направленной модификации мтДНК.

Рисунок 2. Схема генетической конструкции для направленной модификации митохондриального генома.

5.     Задачи, планируемые на перспективу: 

• Получение трансгенных линий мышей с маркированной экспрессией гена tubb3 для изучения процессов нейрогенеза и трансдифференцировки.
• Разработка методов доставки генетических конструкций и/или их продуктов в митохондрии и оценка эффективности этих методов.
• Характеристика системы направленной модификации митохондриального генома и оценка её эффективности для супрессии мутаций.

Бывшие сотрудники

Совместители

Публикации

2009	Magnetic Field Effect in the Reaction of Recombination of Nitric Oxide and Superoxide Anion Karogodina TY, Sergeeva SV, Stass DV APPL MAGN RESON, 2009, V.36 I:2-4 P: 195-208
2006	Development of behavioural dysfunctions in accelerated-senescence OXYS rats is associated with early postnatal alterations in brain phosphate metabolism Sergeeva S.V., Bagryanskaya E.G., Korbolina E.E., Kolosova N.G. EXP GERONTOL, 2006, 41(2):141-50.
	Long-term antioxidant suplementation attenuates oxidative stress markers and cognitive deficits in senescent-accelerated OXYS rats Kolosova N.G., Shcheglova T.V., Sergeeva S.V., Loskutova L.V. NEUROBIOL AGING, 2006, 27(9):1289-97

Конференции

2008	Magnetic Field Effects in the Reaction of Recombination of Nitric Oxide and Superoxide Anion Karogodina T.Y., Stass D.V. and Sergeeva S.V. 1st International Conference RAHMS: Recent Advances in Health and Medical Sciences, Paphos, Cyprus, March 7-12, 2008
2007	Searching for Magnetic Field Effects in the Recombination of Rapidly Relaxing Biologically Relevant Radicals Stass D.V., Karogodina T.Yu., Sergeeva S.V. International Conference on Magneto-Science ICMS2007, Hiroshima, Japan, November 11-15, 2007
2006	Searching for Magnetic Field Effects in Recombination of Nitric Oxide and Superoxide Anion Karogodina T.Yu., Sergeeva S.V., Stass D.V. 5th Asia-Pacific EPR/ESR Symposium APES 2006, Novosibirsk, Russia, August 24-27,2006
	Поиск магнитных эффектов в реакции рекомбинации оксида азота и супероксид-радикала Карогодина Т.Ю., Стась Д.В., Сергеева С.В. XVIII симпозиум "Современная химическая физика", Туапсе 22