1.     Основное направление фундаментальных и фундаментально-ориентированных исследований

Разработка технологии создания продуцентов кандидатных субъединичных съедобных вакцин против Mycobacterium tuberculosis на основе генетически модифицированных растений моркови и оптимизация экспрессии целевых генов. Изучение межклеточных контактов и динамики цитоскелета в материнских клетках микроспор на моделях трансгенных растений и разноплоидных линиях табака.

2.     Задачи, решаемые в настоящее время в рамках базового бюджетного проекта

• Создание трансгенных растений моркови с генами esat6 и cfp10 M.tuberculosis методом агробактериальной трансформации;
• Исследование иммуногенных характеристик трансгенной моркови с рекомбинантными антигенами ESAT6 или CFP10 (оценка клеточного и гуморального иммунитета);
• Создание генетической конструкции c генами esat6 и cfp10 M.tuberculosis и геном дельтаферона человека (dIFN) в слитой форме;
• Создание трансгенных растений моркови с химерным геном и cfp10-esat6-dIFN M.tuberculosis методом агробактериальной трансформации
• Сравнительный анализ иммуногенных характеристик трансгенной моркови с химерным рекомбинантным белком CFP10-ESAT6-dIFN и трансгенной моркови с рекомбинантными белками ESAT6 или CFP10 (оценка клеточного и гуморального иммунитета);
• Оптимизация экспрессии целевых генов путем введения тканеспецифичных регуляторных элементов в состав генетических конструкций для экспрессии в клетках растений;
• Создание суспензионных клеточных культур на основе нескольких видов трансгенных растений;
• Оценка клеточных линий табака, люцерны и амаранта по уровню экспрессии gfp-гена.

3.     Прикладные разработки

В лаборатории разработаны генетические конструкции с генами esat6 и cfp10 M.tuberculosis и геном dIFN человека, разработан способ получения трансгенных растений моркови и способ культивирования клеточной культуры табака. Разработки защищены патентами.

4.     Иллюстрированное описание лучших результатов, полученных подразделением за последние 5 лет

Разработаны три типа генетических конструкций с генами cfp10 и esat6 M.tuberculosis, в двух из которых целевые гены были представлены в виде индивидуальных генов и в третьей (рис.1 А) – в слитой форме с добавлением гена дельтаферона человека для экспрессии в клетках растений (Патент №2468082 от 27 ноября 2012 г.).

Включение гена дельтаферона человека в состав генетической конструкции предполагало использование рекомбинантного дельтаферона в качестве адьюванта и иммуномодулятора, усиливающего иммунный ответ к антигенам M.tuberculosis. Дельтаферон является рекомбинантным аналогом γ-интерферона человека, синтезируется в растворимой нативной форме, имеет повышенную устойчивость к протеазам крови и сниженную противовирусную активность.

Рисунок 1. Схема генетической конструкции химерного гена cfp10-esat6-dIFN для экспрессии в клетках растений (А) и продукты его экспрессии (Б), выявляемые Вестерн-блот анализом экстрактов (суммарный растворимый белок) из корнеплодов трансгенных растений моркови

Обозначения: RB и LB – повторы, окаймляющие Т-область плазмиды; pNOS и tNOS - промотор и терминатор гена нопалинсинтазы Тi-плазмиды A.tumefaciens; nptII – ген неомицинфосфо-трансферазы II E.coli; CaMV35S – промотор гена 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; cfp10 и esat6 – гены секреторных белков M.tuberculosis; dIFN – ген дельтаферона человека; uidA – ген бета-глюкуронидазы E.coli. Стрелками указаны сайты рестрикции BamHI и XbaI. 1- (контроль) - очищенный rCFP-10-ESAT-6-dIFN, наработанный в E. сoli (10 нг); 2 - экстракт корнеплодов трансгенной моркови. Справа указаны молекулярные массы визуализируемых фрагментов и их предполагаемый состав.

Разработан способ получения трансгенных растений моркови (Патент №2374321 от 27 ноября 2009). Получены линии трансгенной моркови, в тканях корнеплодов которых синтезировались рекомбинантные белки M. tuberculosis и химерный (рис. 1 Б) рекомбинантный белок (ESAT6 - 0,056% ОРБ; CFP10 - 0,002 %; CFP-10-ESAT-6-dIFN – 0.058%). Продемонстрировано формирование клеточного и гуморального иммунных ответов при пероральной доставке исследуемых рекомбинантных CFP10- и ESAT6-иммуногенов экспериментальным животным. Установлено, что исследуемые иммуногены способны синтезироваться в растительных клетках, накапливаться в тканях растений на уровне, достаточном для формирования иммунного ответа и сохранять свои биологические свойства при прохождении через желудочно-кишечный тракт животных. Формирование иммунного ответа при пероральной доставке рекомбинантного CFP10, синтезируемого в тканях корнеплодов трансгенных растений моркови, выявлено нами впервые. Установлено, что ESAT6 проявлял токсичность по отношению к мононуклеарам периферической крови. Мы предположили, что токсичность ESAT6 может быть снижена в присутствии адьюванта, в качестве которого нами был использован дельтаферон человека.

Установлено, что химерный белок CFP10-ESAT6-dIFN обладал способностью индуцировать гуморальные и клеточные звенья иммунитета при пероральном (корнеплоды трансгенной моркови) и инъекционном (очищенный рекомбинантный белок, синтезируемый в E.coli) введении в организм животных (самцы мышей в возрасте 6-7 недель инбредной линии BALB/c, SPF-виварий ИЦиГ СО РАН, Новосибирск). На рисунке 2 представлены результаты оценки клеточного звена иммунитета у исследуемых животных при пероральной доставке антигенов. Добавление рекомбинантных CFP10 (рис 2, слева) и ESAT6 (рис 2, справа) к сывороткам крови мышей, получавших в эксперименте исследуемые иммуногены перорально, стимулировало пролиферацию лимфоцитов независимо от того, как был представлен иммуноген – индивидуально либо в составе химерного белка (различия достоверны при P<0,05 по сравнению с контролем).

Рисунок 2. Оценка клеточного звена иммунитета у мышей в ответ на CFP10 (слева) и ESAT6 (справа) при пероральной доставке иммуногенов (в составе моркови. Обозначения: ES_C_IF – химерный белок ESAT6-CFP10-dIFN; control – нетрансгенные растения моркови.

Принципиально важно, что рекомбинантный ESAT6 в составе химерного белка не оказывал цитотоксического эффекта в отношении мононуклеаров периферической крови, что подтвердило правильность выбора дельферона в качестве адьюванта. Дельтаферон в составе химерного белка оказывал пролиферативное влияние на спленоциты неиммунизированных мышей, что подтверждало его биологическую активность. Установлено, что пероральная доставка CFP10-ESAT6-dIFN-антигена не отличалась по стимуляции клеточного иммунитета от эффективности, наблюдаемой при инъекциях соответствующего рекомбинантного химерного белка. Это особенно важно, поскольку именно Th1-тип иммунного ответа играет ведущую роль в противостоянии организма заражению M. tuberculosis. Важным итогом выполненных работ является первая демонстрация того, что морковь, корнеплоды, которой можно использовать в пищу без термообработки, в дальнейшем может составить платформу для создания кандидатной съедобной субъединичной рекомбинантной вакцины.

Созданы генетические конструкции с промоторами (apetala3 и prs4A) тканеспецифичных генов A.thaliana на основе плазмиды pNPB-TS (рис. 3 а), обеспечивающие экспрессию репортерного uidA-гена в активно делящихся клетках табака: в зоне апикальных (рис. 3 б) и корневых меристем (рис. 3 в).

Созданные конструкции предназначены для усиления экспрессии целевых генов у трансгенных растений в активно делящихся клетках апикальных и корневых меристем, в том числе в клетках каллусов. Способность промотора обеспечивать экспрессию в активно делящихся клетках представляет интерес для получения высокоэффективных клеточных линий как продуцентов фармацевтически ценных белков, поскольку скорость деления клеток может регулироваться in vitro экзогенными факторами. Способ культивирования клеточной линии табака in vitro защищен патентом (Патент №2354692 от 10 мая 2009 г.). Гистохимическое определение активности β-глюкуронидазы подтвердило экспрессию uidA-гена в клетках каллусов (рис. 3 г; голубое окрашивание). Созданные генетические конструкции предусматривают возможность замены репортерного гена на последовательности целевых генов.

Рисунок 3. Генетическая конструкция и варианты экспрессии uidA-гена в тканях трансгенных растений и каллусов табака. a – схема генетической конструкции для тканеспецифической экспрессии трансгенов в растениях; б, в – uidA-экспрессия (голубое окрашивание) в апикальной меристеме и меристеме корней у проростков трансгенного табака; г – uidA-экспрессия (голубое окрашивание) в каллусных тканях трансгенного табака; (Обозначения: RB и LB – повторы, окаймляющие Т-область плазмиды; pNOS - промотор гена нопалинсинтазы Тi-плазмиды A.tumefaciens; nptII – ген неомицинфосфо-трансферазы II E.coli; tNOS - терминатор гена нопалинсинтазы Тi-плазмиды A.tumefaciens; uidA – последовательность гена бета-глюкуронидазы E.coli).

Проведен отбор клеточных линий нескольких видов растений по скорости нарастания биомассы in vitro, как одного из этапов разрабатываемой в лаборатории технологии получения рекомбинантных фармацевтически ценных белков в растительных системах на основе клеточных суспензионных культур.

Создана генетическая конструкция (Рис. 4 а) с геном GFP зеленого флюоресцирующего белка (Рис. 4 б), что позволило количественно оценивать уровень накопления рекомбинантного белка. Отобрана клеточная линия амаранта (Рис. 4 в), характеризующаяся высокой скоростью накопления биомассы клеток (десятикратное увеличение биомассы клеток за 15 дней культивирования).

Рисунок 4. Разработка биоинженерной платформы нового поколения для экспрессии целевых генов в суспензионных культурах клеток генетически модифицированных растений: а - схема вектора с маркерным геном GFP; б - флюоресценция GFP-белка; в - прирост биомассы клеток амаранта в суспензионной культуре на 10-ый и 15-ый день культивирования.

При создании трансгенных растений табака выделены уникальные линии с высоким уровнем (более 40%) цитомиксиса, используемые в качестве моделей для изучения фундаментальной проблемы межклеточных взаимодействий.

Цитомиксис, или межклеточное перемещение ядер по цитомиктическим каналам (рис. 4 а), исследован на клеточном и ультраструктурном уровнях. Впервые показано, что перемещение ядер не связано с нарушениями функций тубулинового цитоскелета и происходит без нарушения ядерной оболочки (рис. 4 б). Результатом цитомиксиса может быть слияние оболочки перемещающегося ядра с оболочкой ядра клетки-реципиента и образование межъядерного мостика (рис. 4 в). Впервые установлено, что формирование цитомиктических каналов происходит с участием сферосомоподобных везикул (рис. 4 г), содержимое которых обладает ферментативной активностью (рис. 4 д).

Рисунок 4. Цитомиксис в материнских клетках микроспор табака (а – световая микроскопия, б-д – электронная микроскопия).

а, б – цитомиксис (стрелки) в профазе 1 мейоза;

в – стрелкой указан сформированный межъядерный мостик, на врезке представлен его увеличенный фрагмент; г – сферосомоподобная везикула; д – распад везикулы и выделение фермента каллазы при формировании межклеточного цитомиктического канала (указано стрелкой).

Обозначения: я – ядро; кс – клеточная стенка; хр – хроматин; сф – сферосомоподобная везикула.

Для детального исследования причин и механизмов межклеточных взаимодействий в лаборатории создана коллекция разноплоидных линий табака (гаплоиды, триплоиды и тетраплоиды).

5.     Задачи, планируемые на перспективу

Дальнейшие работы коллектива лаборатории направлены на совершенствование генетической конструкции для повышения уровня экспрессии химерного рекомбинантного белка в тканях трансгенных растений. Полученный нами химерный белок CFP10-ESAT6-dIFN безусловно представляет интерес в качестве кандидатной съедобной вакцины и нуждается в дальнейших дополнительных исследованиях. Следующим этапом нашей работы предполагаются исследования по разработке и совершенствованию генетической конструкции с геном cfp10-esat6-dIFN. Планируется усиление иммуногенности CFP10-ESAT6-dIFN за счет слияния с CTB-антигеном, а также проведение генно-инженерных работ по введению фрагментов ДНК, кодирующих аминокислотные последовательности, обеспечивающие связывание рекомбинантного химерного белка с поверхностями аффинных носителей. Для защиты целевого рекомбинантного белка от протеолитических ферментов клеток растений планируется обеспечение его локализации в люменах эндоплазматического ретикулума. Предусматривается сравнительный анализ формирования пулов СD4+ и CD8+ T-клеток у лабораторных животных (мыши) в зависимости от способов доставки рекомбинантного химерного белка (CFP10-ESAT6-dIFN). Предполагается оценить соотношение СD4+/CD8+ T-клеток при пероральной доставке CFP10-ESAT6-dIFN в организм мышей (съедобная вакцина) и при доставке CFP10-ESAT6-dIFN в организм мышей в виде фрагмента ДНК (ДНК-вакцина). Планируется исследование характеристик рекомбинантного химерного белка, синтезируемого в тканях корнеплодов трансгенных растений моркови, таких как сохранение его иммуногенных характеристик в зависимости от длительности хранения корнеплодов моркови, а также при лиофилизации тканей корнеплодов. Конечной целью данной работы является разработка новой безопасной и эффективной кандидатной вакцины от туберкулеза, которая могла бы заменить или дополнить вакцину БЦЖ для интактных или привитых штаммом БЦЖ детей, взрослых и животных.

В рамках направления по созданию трансгенных растений в качестве биопродуцентов рекомбинантных белков будут закончены работы по оценке эффективности использования тканеспецифичных промоторов для экспрессии трансгенов в растительных меристемах. Созданные генетические конструкции предусматривают возможность замены репортерного гена на другие последовательности. Это позволит использовать их для создания клеточных культур, обеспечивающих повышенный уровень экспрессии целевых генов и накопление рекомбинантных белков в активно делящихся клеточных культурах.

Планируется продолжение анализа цитомиксиса в микроспорогенезе растений с использованием созданных в лаборатории разноплоидных линий табака. Так как цитомиксис это процесс миграции ядер между растительными клетками, который, как предполагается, имеет эволюционное значение, оказывая влияние на качественный состав продуктов мейоза путем формирования анеу-, ди- и полиплоидных гамет, то изучение клеточных механизмов, причин и последствий цитомиксиса является важной фундаментальной проблемой биологии развития, клеточной биологии и межклеточной коммуникации растений. Выявление и понимание клеточных механизмов цитомиксиса, возможно, будет иметь значение для решения прикладных задач репродуктивной биологии, поскольку аномально высокая частота цитомиксиса является одним из основных нарушений мейоза у гибридных и полиплоидных форм хозяйственно-ценных растений. В рамках данной работы на ближайшие 5 лет планируется: 1) проанализировать мигрирующий между клетками при цитомиксисе хроматин, выявить какие хромосомы мигрируют между клетками и в каком функциональном состоянии находится хроматин при цитомиксисе; 2) определить, какова дальнейшая судьба мигрировавшего хроматина после цитомиксиса; 3) установить, присутствуют ли в клетках после цитомиксиса маркеры программируемой клеточной гибели; 4) продолжить анализ клеточных механизмов миграции ядер между растительными клетками на ультраструктурном уровне.

Для проведения вышеперечисленных работ будет использованы метод FISH, анализ посттрансляционной модификации гистонов, TUNEL-анализ и методы высокоразрешающей электронной микроскопии

Будут продолжены исследования роли и взаимодействия актиновой и тубулиновой форм цитоскелета в регуляции деления растительных клеток и межклеточных взаимодействий на примере материнских клеток микроспор трансгенных растений табака. К настоящему времени стало очевидным, что существующие методы визуализации различных форм растительного цитоскелета (введение меченых мономеров, иммунофлюоресцентное окрашивание с использованием антител), несмотря на достаточно высокую разрешающую способность, имеют ряд существенных недостатков. В частности к ним относятся невозможность прижизненного окрашивания цитоскелета и невозможность одновременной визуализации в микроспорогенезе тубулина и актина, что связано с особенностями фиксации последнего. Выходом из положения является создание трансгенных растений, экспрессирующих химерные гены, в которых кодирующая последовательность репортерного белка GFP слита с последовательностью, кодирующей домен связывания с актином/тубулином. Учитывая, что известные конститутивные промоторы не обеспечивают уровня экспрессии, достаточного для визуализации цитоскелетных структур в материнских клетках микроспор, для визуализации цитоскелета кодирующие последовательности маркерных генов будут поставлены под управление промоторов, обладающих специфической активностью в микроспорогенезе

Бывшие сотрудники

Совместители

Публикации

2012	АНАЛИЗ МОЗАИЧНОГО ПРОЯВЛЕНИЯ nptII-ГЕНА У КОНТРАСТНЫХ ПО МОЗАИЦИЗМУ ЛИНИЙ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА Д.Б. Логинова, П.Н. Меньшанов, Е.В. Дейнеко RUSS J GENET+, 2012, Т.48, №11, с.1280-1286
2010	Rational design based synthetic polyepitope DNA vaccine for eliciting HIV-specific CD8+T cell responses Bazhan SI, Karpenko LI, Ilyicheva TN, Belavin PA, Seregin SV, Danilyuk NK, Antonets DV, Ilyichev AA MOL IMMUNOL, 2010, volume: 47 Issue: 7-8 Pages: 1507-1515
2009	Design of Artificial Polyepitope DNA Vaccine Constructs for Eliciting of HIV-Specific CD8+CTL Responses Oreshkova S, Bazhan S, Belavin P, Ilyicheva T, Seregin S, Ilyichev A , Karpenko L ANTIVIR RES, 2009, Volume: 82 Issue: 2 Pages: A25-A25
2007	Formation and function of phragmoplast during successive cytokinesis stages in higher plant meiosis Shamina N.V., Gordeeva E.I., Kovaleva N.M., Seriukova E.G., Dorogova N.V. CELL BIOL INT, 2007, v.31, pp 626-635
	Mosaic expression pattern of the nptII gene in transgenic tobacco plants Nu21 Marenkova T.V., Deineko E.V., ShumnyV.K. RUSS J GENET+, 2007, №7,V43, pp780-790
	Regulatory genes of garden pea (Pisum sativum L.) controlling the development of nitrogen-fixing nodules and arbuscular mycorrhiza: A review of basic and applied aspects. Borisov A. Yu., Danilova T. N., Koroleva T. A., Kuznetsova, E. V., Madsen L., Mofett M., Naumkina T. S., Nemankin T. A., Ovchinnikova E. S., Pavlova Z. B., Petrova N. E., Pinaev A. G., Radutoiu S., Rozov S. M., Rychagova T. S., Shtark O. Yu., Solovov APPL BIOCHEM MICRO+, 2007, v.43 N3, p. 237-243, 2007
2006	The effect of duplications in the T-DNA on the stability of manifestation of heterologous genes in transgenic tobacco plants Marenkova T.V., Deineko E.V. RUSS J GENET+, 2006, №5,V42, pp526-531
	A change in the stability of marker nptII and uidA gene expression in transgenic tobacco plants Marenkova T.V., Deineko E.V. RUSS J GENET+, 2006, №5,V42, pp518-525